一种复合菌对疲劳小鼠肠黏膜屏障的影响及其作用机制

摘要：目的：通过负重游泳实验，观察一种复合菌对小鼠的抗疲劳作用及其在疲劳状态下对肠道粘膜屏障的影响，并初步探讨其机制。方法：50只昆明小鼠（4～6周龄）随机分为5组：空白组、疲劳模型组、嗜酸乳杆菌干预组、干酪乳杆菌干预组、复合菌干预组，每日进行灌胃、负重游泳。6 w后取小鼠眼球血及小肠组织，测定肠黏膜损伤程度相关指标、细胞因子水平和蛋白水平的表达。研究期间每周测量1次小鼠体重。结果：研究结束时，各组小鼠体重均升高，各组间无显著性差异（P＞0.05）；血清中肠黏膜物理屏障相关指标DAO、D-LA水平以复合菌组最低，其次是干酪乳杆菌组，与空白组和疲劳模型组比较均有显著性差异（P＜0.05或＜0.01），而Endotoxin水平各组间无显著差异（P＞0.05）。血和小肠中炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、MPO水平3个干预组与空白组和疲劳模型组相比均有显著性差异（P＜0.05或＜0.01），而IL-6、IL-1β、sIgA水平与疲劳模型组相比无显著性差异（P＞0.05）。小肠中蛋白水平MUC2、ZO-1、Occludin、Claudin-2的表达3个干预组和疲劳模型组相比较均有显著性差异（P＜0.05或＜0.01）。结论：复合菌能显著延长小鼠力竭游泳时间；嗜酸乳杆菌与干酪乳杆菌均在不同程度上抑制了血清及肠道细胞因子的释放；促进了相应蛋白水平的表达；初步认为复合菌通过增加对小鼠肠道屏障的保护作用发挥抗疲劳作用。

关键词：疲劳；肠黏膜屏障；嗜酸乳杆菌；干酪乳杆菌；炎性因子肠道不仅是消化和营养吸收的重要器官，而且具有免疫调节、内源性免疫功能和黏膜屏障功能，与身体健康密切相关。越来越多的实验证据表明，疲劳会对不同器官造成损害，尤其是肠道，可诱导胃肠道炎症[1]。过度疲劳可引起严重的原发性肠屏障功能障碍，促进细菌和内毒素易位，引起全身炎症反应，对机体造成损害。据报道，肠道微生物群、黏膜屏障功能和免疫系统之间的相互作用在疲劳机制中发挥了作用[2]。因此，保护肠黏膜屏障功能是降低疲劳对机体损伤的重要环节。

益生菌是对胃肠道疾病具有广泛治疗潜力的活微生物，可以通过抑制病原体的黏膜黏附，改善上皮屏障功能，以及改变宿主的免疫活性，还可以调节腔内发酵，稳定肠道菌群，预防和缓解胃肠道功能紊乱[3]。此外，益生菌还可改善肠道运动障碍[4]。在动物模型中观察到了其对肠屏障功能的增强作用。

乳酸菌（LAB）是一种重要的益生菌，作为微生物赋予宿主健康利益。乳酸菌对抗疲劳独立作用的研究较少，但已被证明可以预防和减轻胃肠道紊乱，并使细胞因子水平正常化[5]，这可能对疲劳人群有好处。因此，在前期研究基础上[6]，本研究给予疲劳小鼠嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌干预，通过评价其肠黏膜屏障功能，血清和肠道中炎症相关指标和小肠紧密连接蛋白表达水平的变化，评估和比较独立乳酸菌及复合菌对疲劳小鼠肠黏膜屏障的保护作用及其抗疲劳效果。

1材料与方法

1.1材料和试剂

嗜酸乳杆菌粉、干酪乳杆菌粉、复合菌粉，均由辽宁中世生物技术有限公司提供；肿瘤坏死因子-α（TNFα）、白细胞介素-1β （IL-1β）、白细胞介素-6 （IL-6）、白细胞介素-4 （IL-4）、白细胞介素-10 （IL-10）、黏蛋白-2 （MUC2）、紧密连接蛋白1 （ZO-1）、闭合蛋白（Occludin）、封闭蛋白-1 （Claudin-1）、封闭蛋白-2 （Claudin-2）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、内毒素（Endotoxin）、D-乳酸（D-LAC）、干扰素γ （IFN-γ）、髓过氧化物酶（MPO）、二胺氧化酶（DAO）、BCA蛋白检测试剂盒，均购自南京建成有限公司。

1.2实验动物分组及疲劳模型的建立

SPF级健康46 w龄雄性昆明小鼠[（38 ± 2） g]，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。所有小鼠在特定的无病原体条件下 （24～26°C，12/12 h 明暗交替的安静环境，湿度50%～60%），自由采食饮水。适应性喂养1 w后，将50只小鼠随机分为5组，每组10只小鼠：空白组 （生理盐水0.2 mL/d）、疲劳模型组（生理盐水0.2 mL/d）、嗜酸乳杆菌干预组 （嗜酸乳杆菌1x10⁹ cfu）、干酪乳杆菌干预组 （干酪乳杆菌1×10⁹ cfu）、复合菌干预组 （嗜酸乳杆菌：干酪乳杆菌=1：1，1×10⁹ cfu），连续灌胃6 w，研究期间以普通饲料喂养。

除空白组外小鼠每日灌胃样品30 min后负重游泳，将鼠尾部按小鼠体重5%负荷铅放入同一水箱（水深不少于40 cm）中且互补接触，游泳时间保证在120 s以上，并记录游泳时间。力竭标准：小鼠协调动作消失，水淹没鼻尖，身体下沉至再次浮出水面的时间超过10 s，并连续3次者，视为力竭。末次游泳后，静息30 min后处死小鼠，采集眼球血、结肠、回肠组织进行相关指标分析。所有动物实验均按照国家《实验动物护理和使用指南》进行。

1.3小鼠血清中肠黏膜屏障功能相关指标测定

取冻存的血清上清液，按照小鼠 DAO、D-LAC ELISA 试剂盒产品说明书操作测定小鼠血清DAO、D-LAC含量。按照鲎试剂 （LAL）QCL 1000TM试剂盒说明书操作测定小鼠血清中内毒素含量。

1.4小鼠小肠组织中4种紧密连接蛋白含量测定

取冻存的小肠组织上清液，运用BCA法测定小肠组织蛋白浓度，再根据ELISA检测试剂盒说明检测小鼠小肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin-1、Claudin-2的含量。

1.5小鼠血清和肠道中炎症相关指标测定

取冻存的血清、小肠组织和肠黏液上清液，运用 BCA法测定小肠组织蛋白浓度，再根据小鼠ELISA 检测试剂盒说明分别检测血清、小肠组织和肠黏液上清液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、MPO、sIgA炎症相关因子水平。

1.6统计分析

实验数据以X±SD 表示，采用Graphpad Prism 8.0.2统计软件进行数据处理。统计软件进行单因素方差统计学分析和Tukey-Kramer多重比较检验，P<0.05为具有统计学意义的显著性差异。

2结果与分析

2.1体重的变化情况

实验开始时各组小鼠体重相当，没有显著性差异（P>0.05）。经不同益生菌灌胃干预6 w后，各组小鼠的平均体重均逐渐增加，建模49 d后，空白组体重为（51.90±2.81）g，体重高于各游泳组体重值，模型组与各干预组之间体重差异无统计学意义（P>0.05）（表1） 。

2.2不同益生菌对小鼠力竭游泳时间的影响

如图1所示，实验期间，空白组作为不干扰组，不参与游泳。各治疗组游泳时间呈波浪式增长，连续灌胃的前3周，各益生菌组较模型组相比力竭游泳时间无显著性差异（P>0.05）。当灌胃5 w后，模型组与复合菌组间游泳时长存在极显著性差异（P<0.01），而嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌组与模型组间无显著性差异（P>0.05）。灌胃6 w后，干酪乳杆菌和复合菌组与模型组相比存在极显著性差异（P<0.01），嗜酸乳杆菌组游泳时间虽有所增加，但与模型组相比无差异（P>0.05）。

2.3复合菌对疲劳小鼠肠黏膜屏障功能的影响

与空白组相比，力竭游泳6 w后，模型组小鼠血中DAO活性相比空白组升高 （P<0.05），说明长时间持续疲劳对小鼠肠黏膜屏障造成了损伤。在连续灌胃益生菌后，与模型组相比，小鼠血液DAO活性明显低于模型组（P<0.01），其中，复合菌组效果最好，其次是干酪乳杆菌组，嗜酸乳杆菌组效果最弱，复合菌组与其余2组菌组比较存在显著性差异（P<0.05）。游泳对照组小鼠与空白组相比，血清D-LA活性显著升高 （P<0.01），灌胃益生菌各游泳组与游泳对照组相比，复合菌组D-LA活性显著降低（P<0.01），干酪乳杆菌组D-LA含量虽有所降低，但无显著性差异（P>0.05），嗜酸乳杆菌组D-LA活性无显著变化（P>0.05） （图2）。各组小鼠血清中内毒素水平无显著性差异（P>0.05），说明益生菌对疲劳小鼠血中内毒素水平没有明显的抑制作用（图3）。

2.4复合菌对疲劳小鼠紧密连接蛋白的影响

模型组小鼠肠道各类蛋白含量与空白组相比存在极显著性差异（P<0.01），表明疲劳可能使得小鼠肠道屏障受到损伤。灌胃各益生菌后与模型组相比小鼠肠ZO-1、Occludin和Claudin-2含量均有显著性升高（P<0.05或P<0.01）；除嗜酸乳杆菌组外，其余2组益生菌组与模型组相比小鼠肠Claudin-1含量也均有显著升高（P<0.01）（表2）。

2.5复合菌对疲劳小鼠血清炎性因子的影响

干预6 w后，模型组小鼠促炎因子TNF-α和IFN-γ水平显著高于空白组（P<0.01），灌胃益生菌组小鼠血液中TNF-α和IFN-γ明显降低，其中干酪乳杆菌组和复合菌组与模型组间存在极显著差异（P<0.01）；而小鼠血清促炎细胞因子IL-1β和IL-6水平与模型组差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。与空白组相比，抗炎因子IL-10和IL-4的含量均显著下降（P<0.05），而益生菌组都有所升高（P<0.05），复合菌组与模型组相比存在极显著差异（P<0.01）。这些作用与炎性因子作为炎症介质的作用导致的促炎因子下调和抗炎因子上调相一致[7]。

2.6复合菌对疲劳小鼠肠道免疫因子的影响

较空白组，疲劳使模型组小鼠肠黏膜sIgA的分泌量显著降低，随着益生菌的灌胃其分泌量有所上升，模型组与其余游泳组间无显著性差异（P>0.05）。说明疲劳后益生菌对小鼠肠黏膜sIgA分泌没有明显促进作用。模型组小鼠肠黏膜MPO活力水平较空白组明显升高（P<0.05），灌胃益生菌后小鼠肠黏膜MPO活力水平明显低于模型组（P<0.01），其中复合菌组水平最低。说明益生菌强化肠内营养可以明显抑制疲劳引起的肠黏膜中性粒细胞活化，降低肠黏膜炎症浸润情况（图4）。

3讨论

疲劳的生理状态，包括特发性疲劳、慢性疲劳综合征和不明确的疲劳，对机体都有不利影响，包括社会心理、身体、情感方面，并对健康相关的生活质量产生负面影响。有研究表明，益生菌可以促进能量收集，并具有促进健康、提高性能和抗疲劳的作用[8]。本研究通过对干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和复合菌进行了初步的探索探究，证实了复合菌对肠黏膜屏障的保护作用和由此产生的抗疲劳效果，进一步对保护肠屏障机制进行了探讨。本研究疲劳小鼠模型的结果显示，无论是灌胃生理盐水还是不同益生菌，小鼠体重和游泳时间都有不同程度的升高，而体重的变化和运动耐力是机体疲劳的最直接和最客观的证据，说明益生菌对疲劳恢复具有一定促进作用。

疲劳中众多因素的存在可能导致肠黏膜屏障的损伤[9]，从而造成多种肠道及全身性疾病。血液中内毒素水平是衡量肠黏膜屏障功能的重要指标，当肠黏膜屏障受损时，肠源性内毒素通过受损的肠黏膜屏障进入血液[10]。而实验结果显示，实验各组间内毒素水平没有显著差异，说明力竭游泳实验后产生的疲劳反应对昆明小鼠肠黏膜屏障功能没有影响。血清D-乳酸水平和DAO活性水平被认为是肠通透性的敏感生物标记物，用来检测肠损伤程度[11]，本研究中复合菌的添加对疲劳小鼠血清中DAO和D-LA活力的上升表现出明显的抑制作用。Deng等[12]研究结果也表明，益生菌（干酪乳杆菌）能够明显降低鸡肠道DAO、D-LA的分泌。说明益生菌的施用改善了肠道通透性，保护了肠黏膜屏障功能。