玉米中赭曲霉毒素A的辐照降解及辐解产物的毒性评价

摘要：目的：评价γ射线对赭曲霉毒素A降解的影响和辐射分解产物的特性。方法：对甲醇水溶液中的赭曲霉毒素A（OTA）进行60Coγ射线辐照处理。结果：γ射线能有效地降解水溶液中的OTA，并可以检测出4种主要的辐解产物。在4 kGy的辐照剂量下，OTA（200 ng/mL）的辐照降解效率可达90%。一种辐解产物毒性低于OTA，其余产物均无毒性记录。 OTA可影响小鼠的生长状态，如体重增加和食物利用率，OTA的辐射降解产物大多不产生影响。本研究中，OTA可破坏小鼠血小板和淋巴细胞，增加小鼠血清AST、GLU、BUN，降低LDH。小鼠的某些内脏可被OTA破坏，如肝、肾、肺等，但OTA辐解产物对所有脏器均无影响。结论：OTA对小鼠有毒性作用，OTA降解的辐解产物无明显毒性作用。

关键词：赭曲霉毒素A;辐照;辐照产物;降解;毒性赭曲霉毒素A（OTA）是由赭曲霉和青霉产生的一种有毒代谢产物，玉米、小麦等农产品较易受到污染。OTA的毒性主要有肾脏毒、肝毒等，并与一种致命的地方性肾脏疾病（巴尔干地方肾病）有关[1]。此外，Reinhard等[25]通过动物实验研究发现，OTA对动物具有致癌和致畸作用，国际癌症研究机构已将OTA列为2B类人肾致癌物[6]。JECFA规定OTA在人体中的最大耐受剂量为100 ng/kg[7]。有效降解玉米中赭曲霉毒素A，对于保障食品安全及人体健康具有重要研究意义。食品辐照是一种新型的绿色保鲜技术，长期以来被实践证明是一种有效的无污染食品保鲜方法[89]。在所有毒素降解方法中，γ射线降解具有许多其他方法无法比拟的优点，广泛应用于毒素的降解[10]。目前，对OTA的辐解产物及其毒性的研究还没有定论。针对食品成分复杂的特点，本研究设计了以水为基质的实验，研究了γ射线对OTA的降解效果，并对辐照产物进行了分析。由于玉米基质的复杂性，对辐解产物的结构分析比较困难，本实验通过毒理学实验对OTA及其辐照产物的毒性进行了研究，从而阐明辐解产物的安全性，分析降解产物对小鼠的毒性作用。本研究综合考虑玉米贮藏过程中OTA的实际污染状况、辐照降解情况及保证辐照后不引起玉米营养品质的变化，在毒理学实验中OTA浓度选择40 μg/kg，辐照剂量选择10 kGy。

1材料与方法

1.1材料与试剂

赭曲霉毒素A（OTA，纯度>98%），购自Fermentek公司;甲醇（色谱纯），购自Sigma公司;Balb/c小鼠：重量为（25±2）g，购自军事医学科学院。

1.2标准溶液浓度的制备

为进行降解效果实验，将1 mg OTA溶于100 mL甲醇中，经梯度稀释制成500、200、100、50、10、5、1 ng/mL标准液（稀释液为6：4体积甲醇水）。对于辐解产物实验，在10 mL甲醇中溶解1 mg OTA制备标准溶液，然后稀释成50 μg/mL 标准液（稀释液为6：4体积甲醇水）。

1.3γ射线辐照处理

在降解率实验中，OTA溶液（200 ng/mL）装于密封的玻璃离心管中，在室温下辐照，辐照剂量为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 kGy。辐照处理地点在北京大学辐照中心，剂量率为0.31 Gy/s，实际吸收剂量用重铬酸银（Ag2Cr2O7）测定计算得到。降解效率（η，%）根据式（1）计算[11]。

（1）

式（1）中，η是降解效率 （%）、Q0是样品的初始浓度 （mg/L）、Qt是辐照后样品的浓度（mg/L）。

色谱条件：HPLCFLD系统（Agilent1100系列，美国），ORBAXSBAQ柱（2.1 mm×3.5 μm×100 mm，流动相为V（甲醇）：V（水）：V（甲酸）=60∶40∶0.1，流速为0.3 mL/min，柱温为35 ℃，进样量5.0 μL，荧光检测器激发波长333 nm，发射波长477 nm。标准溶液曲线揭示了峰面积和OTA浓度的线性关系，线性方程为y=2 011.8x-2 730.6（R2=0.999 8），其中x是OTA的浓度、y是色谱峰面积。 检出限为0.6 μg/mL。 所有样品进行三平行实验。

1.4OTA辐解产物

对于辐解产物实验，在室温下用10 kGy的剂量对密封在玻璃离心管中的OTA溶液（50 μg/mL进行辐照。采用高效液相色谱法（Agilent1100系列，美国），配备ESIQTOFMS检测器（Agilent 6510，美国），对放射性产物进行分析。

1.4.1LC系统运行条件色谱柱为ZORBAX Eclipse PlusC18（2.1 mm×3.5 μm×100 mm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A相）和乙腈（B相）。在10 min内，乙腈（B相）从5%变为90%，并保持2.1 min;然后在5.9 min的时间内，乙腈（B相）从90%变为5%，分析终止时间为18 min、进样量为20 μL、流速为0.3 mL/min。

1.4.2质量系统的运行条件离子源为ESI、离子喷雾电压为3 800 V、干燥气体温度为350 ℃、干燥气体流速为10.0 L/min、雾化气体为N2、极性选择为正、雾化压力为40.0 psig、碰撞能量为15 eV[12]。

1.5体内毒性研究

所有动物都被保存在无病原体的环境中，并按实验要求喂食。照料和使用动物的程序得到了综合农村发展中心伦理委员会的批准，并遵循了所有有关动物伦理使用的条例。将小鼠分为3组，分别为对照组，辐解产物组和OTA组。每组10只小鼠，适应期1周。实验周期持续90天。在此期间，动物自由饮食和饮水。对照组小鼠采用正常饲料喂养;辐照产物组用辐照玉米添加1/4的专用饲料喂养小鼠;OTA组用未经辐照处理玉米添加1/4的专用饲料喂养小鼠。在饲养期间，每天观察记录小鼠的状态和实验指标。

食物摄入量=添加量-残留量（2）

食物利用效率=一定时间内的体重增加量/一定时间内的摄食量*100（3）

血液指标检测实验结束时，禁食12 h，所有动物均从眼眶采血，置入抗凝管，然后电击，防止凝血，检测全血细胞计数。尽可能多的采集血液，在无菌离心管中采血，放置30 min后加入低速离心机，以3 000 r/min离心10 min，取血清，检测血液生化指标（ALT、AST、TP、ALB、GLB、CREA、GLU、BUN、CHOL、TGB、LDH）。使用Windows的统计分析SPSS版本11.5来评估数据。 数据采用方差分析检验进行统计分析。数据以平均值±标准差表示。

2结果与分析

2.1γ射线对水溶液中OTA降解的影响

根据色谱峰面积，计算不同辐照剂量下OTA的降解率η。 在不同的γ辐照剂量下，OTA具有显著的降解应（图1）。当辐照剂量低于1.0 kGy时，降解率要低得多，因为在低照射剂量下没有足够的自由基产生。 随着辐照剂量的增加，降解率也随之提高。在4 kGy的剂量下，降解率可达90%，然后趋于稳定，这一现象在以往关于辐照诱导脱氢乙酸钠在水溶液中降解的研究中也有发现[1314]。

2.2辐照产物质谱分析

通过数据库检索辐射分解产物的可能的化学结构。 当匹配分数达到90%时，该分子一般视为降解产物。此外，它还可以在5 mg/L的质量范围内提供质量精度。然后根据碎片信息和OTA裂解过程推导出产物结构。LC/TOFMS对4种主要辐解产物的准确信息如表1所示。辐照前后，OTA及辐照后OTA降解产物的总离子色谱图（TIC）通过LC/TOFMS获得（图2）。消除杂质和对照，LC/TOFMS共检测4个降解产物，然后分别提取每个峰的二级质谱信息，获得相关离子碎片信息，并对辐解产物的化学结构进行解析。 首先，甲醇水溶液在辐照的过程中会产生羟基自由基（OH）和甲基自由基（CH3），OTA分子结构中的酰胺键在羟基自由基（OH）的作用下裂解，形成降解产物A（苯基丙氨酸）和降解产物B（8羟基3，4二甲基1戊内酯7羧酸），降解产物分子结构如图2B和图2C所示;此外，羟基自由基（OH）和甲基自由基（CH3）会同OTA分子发生加成反应，羟基自由基（OH）和甲基自由基（CH3）分别到OTA内酯环，形成新的化合物C（5氯8羟基3，4二甲基1戊内酯7羰基苯基丙氨酸）和D（5氯4，8二羟基3甲基7羰基苯基丙氨酸），其分子结构如图2D和图2E所示。

2.3玉米中OTA和辐解产物对小鼠体重的影响

摄入OTA后，小鼠会出现中毒症状，如嗜睡、乏力等。 增重和饲料效率的变化将有助于我们研究OTA对其他方面的损害。 研究表明，高浓度真菌毒素污染可导致动物采食量显著降低，影响饲料利用率和体重增加。表2表明，玉米中OTA和辐射分解产物对小鼠体重增加的影响。 在实验中，对照组和辐照组的小鼠精神和活动无异常，无死亡。 然而，在OTA组，6周后，小鼠移动缓慢，1只在9周后死亡。 前5周无显著性差异（P>0.05），后续时间OTA组与对照组和辐照组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。对照组和辐照组，除第6 w外无显著差异（P>0.05），这是由于OTA在10 kGy剂量下未完全降解所致，因此无统计学意义。表3表明，玉米中OTA和辐射分解产物对小鼠饲料效率的影响。与对照组相比，OTA组和降解产物组小鼠的饲料效率没有显著差异（P>0.05）。 从第3周开始，OTA组开始出现显著差异（P<0.05或P<0.01）。 对照和降解产物组除第5周外无显着性差异（P>0.05），这是由于OTA在10 kGy剂量下没有完全降解，因此没有统计学意义。研究表明，OTA对小鼠有一定的损伤，而降解产物对小鼠的毒性较小。本研究结果与迟蕾实验[12]的结果一致。

2.4玉米中OTA和辐解产物对小鼠血液常规指标的影响

表4显示了玉米中OTA和辐解产物对小鼠血液生化参数的影响。 尿氮是肾功能的指标，在严重的肾脏损害中会显著增加[15]。 本研究中，OTA组的尿氮水平明显高于其他2组，表明OTA可损伤肾脏。 谷草转氨酶和丙氨酸转氨酶是肝功能指标[16]。 在OTA组中，谷草转氨酶的显著增加表明OTA破坏了肝脏，结论与Malekinejad的研究一致[17]。 然而，辐射分解产物对肾脏和肝脏的危害较小。乳酸脱氧酶是一种能催化乳酸生成丙酮酸的酶，几乎存在于血液中的所有组织中。在OTA组中，乳酸脱氧酶水平显著降低，导致代谢异常[12，18]。同时，OTA使神经系统紊乱导致血糖水平升高。 我们的结果与Stoycho实验[19]的结果一致。

表5显示了玉米中OTA和辐解产物对小鼠血液常规指标的影响。OTA组的血小板水平显著低于对照组和辐照降解组，而淋巴细胞水平显著高于对照组和辐照降解组。 血小板的主要作用是促进止血和加速凝血，维持毛细血管壁的完整性。研究表明，OTA可诱导淋巴细胞增高，但目前尚未有相关解释。我们推测原因主要是OTA引起的炎症反应。同时OTA可改变红细胞和白细胞水平，其结论存在一定差异，其原因是剂量效应。而辐解产物组与对照组无差异。

3讨论

在不同的γ辐照剂量下，OTA具有显著的降解效应，在本研究中，在10 kg计量辐照下，OTA的降解效率可超过90%。OTA 经辐照降解后，可产生4种不同的辐解产物，经质谱仪分析确定降解产物为苯基丙氨酸、8羟基3，4二甲基1戊内酯7羧酸、5氯8羟基3，4二甲基1戊内酯7羰基苯基丙氨酸和5氯4，8二羟基3甲基7羰基苯基丙氨酸。经过动物实验，可进一步确认OTA对小鼠的体重及其他血液指标的损害，而辐照分解产物则无相应毒性，对肾脏和肝脏的危害也较小。辐照处理可以有效降解OTA，并降低其生物毒性，是降低污染玉米中赭曲霉毒素A的有效手段。参考文献