酶的固定化技术在聚甘油酯生产过程中的应用

酶的固定化技术是指通过物理或化学方法使游离的酶附着在不溶于水的载体上，让酶保持活性且进行反复利用，减少酶的流失、降低酶的使用成本、提高反应效率，较多地应用于聚甘油酯的生产过程中。20世纪70年代以来，我国一直都在开展对固定化技术的研究，目前已经实现了固定化酶在食品、医疗、能源和环境治理等领域的应用。然而，现有的固定化技术仍存在适用范围小和成本较高等问题，需要利用新式材料开发更高效且可持续的固定化酶，控制酶反应并增强其可重复使用性，实现更具成本效益的工艺。

聚甘油脂是一种被联合国粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO），以及欧盟、美国、日本、中国等组织和国家审定批准用作食品添加剂的绿色、安全和多功能性非离子乳化剂。聚甘油酯的生产方法主要包括化学法和酶催化法，化学法是主流。在食品领域，固定化脂肪酶已被广泛应用于脂肪酸酯合成、油脂改性、芳香味酯类化合物以及抗坏血酸酯类抗氧化剂的合成等反应中。

1. 材料与方法

1.1 实验材料

具有特定孔径和表面积的聚丙烯酸树脂颗粒（用于固定脂肪酶）；具有高催化活性和选择性的酶种（TypeⅡ型（L874999）脂肪酶）；磷酸盐缓冲溶液（pH控制在5-9）；三聚甘油（合成聚甘油酯的原料）；不饱和脂肪酸（如油酸或亚油酸）。

实验前需要先对聚丙烯酸树脂颗粒进行预处理：用95wt%乙醇浸泡4-12h，冲洗至无乙醇气味，然后用2-5wt%盐酸溶液浸泡2-4h，水洗至中性，再用1-2wt%氢氧化钠浸泡2-4h，水洗至中性，最后抽滤去除水分后低温保存备用。脂肪酶需置于磷酸盐缓冲溶液中浸泡1-3h，然后离心取上清液备用。

1.2 酶的固定化方法

在去离子水中调节聚丙烯酸树脂颗粒的pH，使其高于脂肪酶的等电点（pI）1.5-2.5个单位。将经过预处理的聚丙烯酸树脂颗粒置于含有脂肪酶的上清液中，确保树脂颗粒与上清液的质量体积比为1：8-1：4。在20℃-40℃条件下，以70-80rpm的转速搅拌反应0.5-3h。取出聚丙烯酸树脂颗粒，干燥后即得到固定化脂肪酶。

1.3 聚甘油酯生产

将油酸和固定化脂肪酶混合均匀混合均匀，在55℃-65℃下搅拌反应3-5h，反应结束后，以固定化脂肪酶催化多不饱和脂肪酸制备聚甘油脂，聚甘油脂与油酸的摩尔比为1：1，固定化脂肪酶的添加量是聚甘油脂和油酸总质量的2%-5%。

2. 实验过程

设置不同组别，分别改变酶的固定化条件（如pH、温度、搅拌转速等），以及聚甘油酯的合成条件（如原料比例、反应温度、反应时间等），观察各因素对聚甘油酯得率的影响。筛选出对得率影响较大的几个因素，再进行正交实验设计，以确定最佳工艺条件。通过称量反应前后物质的质量变化，判定聚甘油酯的产量和得率。组别分别设置为A、B、C组。组别A：改变酶的固定化pH（设置pH为5.5、6.5、7.5）；组别B：改变酶的固定化温度（设置温度为25℃、35℃、45℃）；组别C：改变搅拌转速（设置转速为60、80、100rpm）。

在每个组别下，分别开展酶的固定化和聚甘油酯的合成实验。记录每个条件下的实验结果，特别是聚甘油酯的产量。在初步实验后，选出对得率影响较大的几个因素（如pH、温度、搅拌转速等），再设计一个正交表进行实验，结束后记录下每个条件下的聚甘油酯得率。初步实验结果如表1所示。

根据表1可知，pH、温度对聚甘油酯得率的影响较大。接下来，设计一个正交试验进一步优化这些条件。先确定每个因素的水平范围，设定pH的范围是7-9，温度的范围是20℃-40℃，原料比例的范围是1：1-1：3。然后按照L16（43）正交表（见表2）的设计安排实验。完成所有实验后，收集数据并进行分析，使用方差分析（ANOVA）确定哪些因素对聚甘油酯得率的影响较为显著。聚甘油酯得率方差分析（ANOVA）见表3。

正交试验设计能够明确各因素对聚甘油酯得率的影响，并找到最佳的工艺条件组合，由表4可知，试验6（pH为7.5、温度为35℃、原料比例为1：1）获得了最高的聚甘油酯产量。

3. 结果与讨论

3.1 固定化条件对酶活性与稳定性的影响

在实验中，如果酶活性受到抑制，就会导致聚甘油酯的产量减少。具体来看，在pH为5.5的条件下，酶的活性会受到抑制，从而导致聚甘油酯产量减少。同样，在温度为45℃的条件下，酶的活性也受到了抑制，从而降低了聚甘油酯产量。此外，其他因素如底物浓度、酶浓度、反应时间等，也都会影响聚甘油酯的产量。因此，在实验中需要通过调整固化比例、改变pH和温度、设定适宜的搅拌转速等方式，确保酶与底物的充分混合，进而提高酶的活性，以获得最佳的聚甘油酯产量。

3.2 固定化酶在聚甘油酯生产中的最佳工艺条件

通过正交试验设计，确定了固定化酶在聚甘油酯生产中的最佳工艺条件：pH为7.5、温度为35℃、原料比例为1：1，在此条件下，三聚甘油酯产量达到最高的17.1g。实践也发现，固定化酶在连续五批次的生产中均表现出了出色的稳定性和耐用性，其活性保持率均高于85%，在长期连续生产过程中保持了高效率，降低了酶更换的频率，减少了生产成本。

最重要的是，用固定化酶生产聚甘油酯，减少了杂质和副产物的生成，使得聚甘油酯的纯度更高、色泽更浅、气味更纯正，品质有所提高。这些数据都证实，固定化酶在提高聚甘油酯产量和品质方面具有独特优势。