微生物检测中常用液体培养基的保存期限试验研究

摘 要：研究实验室4种常用选择性和鉴别液体培养基的保存条件及有效期。灭菌后的培养基用封分口膜密封，并分别于2～8 ℃和常温避光保存，在不同时间段（2～8 ℃保存条件下，分别在第15、30、45天和60天；常温保存条件下，分别在第1、3、5天和7 天）通过接种目标菌和非目标菌来验证培养基的选择性和生长率情况。结果表明，所有试验时间段内，4种液体培养基的选择性和生长率均满足相关标准要求。

2～8 ℃密封避光保存60 d的4种液体培养基可用；常温密封避光保存7 d的4种液体培养基可用。

关键词：微生物；培养基；保存期限

Research on the Shelf Life of Commonly Used Liquid Culture Media in Microbiological Detection

SONG Yingying1， WANG Hongying2， GU Min1， ZHANG Rui1

（1.Gansu Analysis and Research Center， Lanzhou 730000， China; 2.Gansu Vocational College of Agriculture， Lanzhou 730000， China）

Abstract： The storage conditions and expiration dates of four commonly used selective and discriminative liquid media in research laboratories. The sterilized medium was sealed with parafilm and stored at 2～8 ℃ and room temperature in the dark， respectively. At different time periods （2～8 ℃， at 15， 30， 45 and 60 days， respectively; stored at room temperature at 1， 3， 5 and 7 days， respectively.）， the selectivity and growth rate indexes of the medium were verified by inoculating target bacteria and non-target bacteria. The results showed that the selectivity and growth rate of the four liquid media met the requirements of the relevant standards in all test periods. Four kinds of liquid medium were available for 60 days at 2～8 ℃. Four kinds of liquid media were used for 7 days of sealed and dark storage at room temperature.

Keywords： microorganisms; culture medium; shelf life

微生物检测工作涵盖范围广且工作量大，专业性强，在质量上有着严格的标准。在整个微生物检验流程中，培养基的配制及保存极为关键，它不仅是开展后续检验工作的基石，更是决定检验准确性和有效性的关键环节[1-3]，对培养基的质量进行控制能有效地确保微生物检测结果的准确性和可靠性[4-5]。

微生物检验工作具有较强的突发性和时效性，实验室通常要随时做好培养基的准备工作以保证样品的即送即检，确保检测数据的准确性及有效性[6-7]。目前，微生物实验室通常使用商品化培养基，包括即用型和脱水合成培养基。即用型培养基只要按照供应商提供的贮存条件保存，并在有效期内按照正确方法使用，即可确保培养基的质量；脱水合成培养基在使用时，检验人员要对其进行配制并在灭菌后方可使用[8]。但目前对灭菌后的脱水培养基的保存条件及保存期限没有明确要求，故众多学者对培养基保存条件及期限展开了研究。刘静等[9]对几种微生物致病菌检测用平板培养基的保存有效期进行了探究，结果表明，在4 ℃冷藏15 d时，这几种平板培养基仍具备可使用性，标准菌株在该培养基上的生长情况良好。翁嘉等[10]对胰酪大豆胨琼脂和沙氏葡萄糖琼脂两种药品微生物计数培养基的保存期限进行了研究，结果表明，两种培养基在2～8 ℃和常温避光保存条件下存放180 d后，其适应性检查结果在0.5～2.0，满足使用要求。高嘉明等[11]研究了灭菌后平板计数琼脂培养基的贮存条件，结果表明，平板计数琼脂在55 ℃恒温保存3 d后，其理化性能及生长率均满足质控要求。余佳珍等[12]研究了经脉动真空灭菌器处理的7.5%氯化钠肉汤、缓冲蛋白胨水和月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤的储存期限，结果表明，在2～8 ℃保存35 d时，3种培养基的pH值、无菌性和质控指标均符合质量控制要求。然而，微生物检测过程中使用的培养基种类繁多，包括固体培养基（平板、斜面）和液体培养基，以上研究多针对常用的固体培养基。

本文选择了食品微生物学检验中大肠菌群计数[13]（MPN法）、大肠埃希氏菌计数[14]（MPN法）和粪大肠菌群计数[15]使用的月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（Lauryl Sulfate Tryptose Broth，LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（Brilliant Green Lactose Bile Broth，BGLB）、EC肉汤，以及水质粪大肠菌群[16-17]测定（多管发酵法）所用的乳糖胆盐发酵培养基，参照《食品安全国家标准 微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2024）[8]，以选择性和生长率为主要验证指标，结合培养基状态以及pH值对以上常用液体培养基的保存条件及期限进行试验研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择性液体计数培养基：LST、BGLB、EC肉汤；鉴定培养基：乳糖胆盐发酵培养基；接种计数培养基：胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA）。上述培养基均由北京陆桥技术有限公司生产。

标准菌株：大肠埃希氏菌CICC 24176、弗氏柠檬酸杆菌CICC 10296、粪肠球菌CICC 23658、肠沙门氏菌肠亚种肠炎血清型CICC 21513。

1.2 仪器与设备

JJ1000电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；LDZM-60L-Ⅲ立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；HR30-IIA2生物安全柜，青岛海尔生物医疗股份有限公司；BSP-250生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；310RS-232数字式温湿度计。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基制备

准确称取乳糖胆盐发酵培养基35.0 g，加入1 000 mL蒸馏水，搅拌使其充分溶解，将培养基分装入含杜氏小管的试管中，每管10 mL，115 ℃灭菌15 min；分别准确称取月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤35.6 g、煌绿乳糖胆盐肉汤40.0 g、EC肉汤37.0 g，加入1 000 mL蒸馏水，搅拌使其充分溶解，将培养基分装入含杜氏小管的试管中，每管10 mL，121 ℃灭菌15 min。灭菌完成待冷却至室温后，在无菌环境下，使用封口膜对每支试管进行密封。随后，每12支试管为一组，其中3支用于培养基状态观察，3支用于pH值测定，3支用于接种，3支为空白对照。分组后的液体培养基用塑料袋密封，分别于2～8 ℃和常温密封避光保存。

1.3.2 培养基质量测试

参照相关标准[8]，以生长率、选择性及生化特性为验证指标，进行培养基质量测试。生长率：用半定量方法将适量测试菌株的菌悬液接种至液体培养基中，用目测的浊度值评估，0表示无浑浊、1表示轻微的浑浊、2表示明显的浑浊，同时记录小导管收集气体的体积比。选择性：将适量测试菌株的菌悬液接种至选择性培养基中，以阳性和阴性（不生长）表示。4种常用液体培养基的质量控制标准见表1。生化特性：在2～8 ℃保存条件下，分别在第15、30、45天和60天观察各液体培养基状态（颜色和澄清度），测量pH值，并接种相应标准菌株（表1）进行质量控制试验，空白对照组接种等量无菌蛋白胨水；常温保存条件下，分别在第1、3、5天和7天观察各液体培养基状态（颜色和澄清度），测量pH值，并接种相应标准菌株（表1）进行质量控制试验，空白对照接种等量无菌蛋白胨水。

1.3.3 标准菌株菌悬液制备

将大肠埃希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌和沙门氏菌分别划线接种于营养琼脂平板上，将粪肠球菌划线接种于血琼脂平板上，36 ℃培养18～20 h后，保存于2～8 ℃冰箱中。每次试验前，从营养琼脂平板上分别挑取4种标准菌株的单菌落，分别接种至装有10 mL营养肉汤的试管中，36 ℃培养18～20 h，然后采用10倍稀释法，用无菌蛋白胨水将4种标准菌株稀释至所需的适宜浓度，备用。

1.3.4 选择性液体计数培养基半定量测试

在待测培养基中接种10～100 CFU的目标菌，同时接种1 000～5 000 CFU的非目标菌，接种3个平行试管，接种体积0.5 mL，混匀，按表1中的条件培养。同时，将相同体积的目标菌和非目标菌悬液倾注TSA平板，计数接种量，每组倾注2个培养皿。

1.3.5 鉴定培养基定性测试

吸取0.05 mL标准菌株菌悬液（约109 CFU·mL-1）置于待测培养基内，按表1中的条件进行培养。

2 结果与分析

4种培养基在不同保存条件下的变化以及质量控制情况见表2～表4。

对于LST，在2～8 ℃和常温密封避光保存条件下，随着存放时间的延长，不同保存时间下的LST颜色、澄清度和pH值（表2）均未发生明显变化。质量控制试验结果（表3）显示，各保存时间段内，目标菌大肠埃希氏菌和弗氏柠檬酸杆菌在LST培养基中均生长良好，有明显的浑浊现象（浑浊度2），且小导管内气体充满管内1/3及以上；而非目标菌粪肠球菌在LST培养基中不生长，未出现浑浊现象。2～8 ℃保存60 d和常温保存7 d的LST培养基的选择性和生长率满足选择性计数培养基的质量控制标准要求。

对于BGLB，在2～8 ℃和常温保存条件下，随着存放时间的延长，培养基颜色、澄清度和pH值（表2）均未发生明显变化。由表3可以看出，各保存时间段内，目标菌大肠埃希氏菌和弗氏柠檬酸杆菌在BGLB培养基中均生长良好，有明显的浑浊现象（混浊度2），且小导管内气体充满管内1/3及以上；而非目标菌粪肠球菌在BGLB培养基中不生长，未出现浑浊现象。说明2～8 ℃保存60 d和常温保存7 d的BGLB培养基的选择性和生长率满足选择性计数培养基的质量控制标准要求。

对于EC肉汤，在2～8 ℃和常温保存条件下，随着存放时间的延长，不同保存时间下的EC肉汤颜色、澄清度和pH值（表2）均未发生明显变化。质量控制实验结果（表3）显示，各保存时间段内，目标菌大肠埃希氏菌在EC肉汤中均生长良好，有明显的浑浊现象（浑浊度2），且小导管内气体充满管内1/3及以上；而非目标菌粪肠球菌在EC肉汤中不生长，未出现浑浊现象。说明2～8 ℃保存60 d和常温保存7 d的EC肉汤的选择性和生长率满足选择性计数培养基的质量控制标准要求。

对于乳糖胆盐发酵培养基，在2～8 ℃和常温保存条件下，随着存放时间的延长，不同保存时间下的乳糖胆盐发酵培养基颜色、澄清度和pH值（表2）均未发生明显变化。质量控制实验结果（表4）显示，各保存时间段内，目标菌大肠埃希氏菌在乳糖胆盐发酵培养基中生长良好，有明显的浑浊现象，培养基变成黄色呈阳性，同时小导管内有气体；而非目标沙门氏菌在乳糖胆盐发酵培养基中不生长，未出现浑浊现象，培养基颜色没有变化呈阴性。说明2～8 ℃保存60 d和常温保存7 d的乳糖胆盐发酵培养基的生化特性满足鉴定培养基的质量控制标准要求。