同位素稀释HPLC-MS法测定爆米花中7种真菌毒素

摘 要：目的：采用同位素稀释超高效液相色谱-串联质谱法建立了一种测定爆米花中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马毒素B1、伏马毒素B2和伏马毒素B3这7种真菌毒素的方法。方法：样品用甲酸-水-乙腈（1∶29∶70，体积比）溶液提取，经稀释、离心、过滤后，取上清液加入一定浓度13C标记的真菌毒素同位素内标溶液，上机测定。结果：7种真菌毒素的线性关系良好，相关系数＞0.999，检出限为0.3～50.0 μg·kg-1，回收率为72.5%～120.0%，相对标准偏差为2.04%～9.73%。结论：该方法操作简单、灵敏度高，能够满足同时测定爆米花中多种真菌毒素的要求。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱；真菌毒素；爆米花

Determination of Seven Mycotoxins in Popcorn by Isotope Dilution HPLC-MS

WANG Haiping， LI Shuang， LI Hui*， WANG Weiguang， QIN Peng

（Rizhao Center for Disease Control and Prevention， Rizhao 276826， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of aflatoxin B1， aflatoxin B2， aflatoxin G1， aflatoxin G2， fumonitoxin B1， fumonitoxin B2 and fumonitoxin B3 in popcorn by isotope dilution ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： The samples were extracted from formic acid-water-acetonitrile （1∶29∶70， volume ratio） solution. After dilution， centrifugation and filtration， the supernatant was added into the internal standard solution of mycotoxin isotope labeled with a certain concentration of 13C. Result： The linear relationship of the seven mycotoxins was good， the correlation coefficient was greater than 0.999， the detection limit was 0.3～50.0 μg·kg-1， the recovery rate was 72.5% to 120.0%， and the relative standard deviation was 2.04% to 9.73%. Conclusion： The method is simple and sensitive， and can meet the requirements of simultaneous determination of fungal toxins in popcorn.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; mycotoxins; popcorn

黄曲霉毒素、伏马毒素是对人体健康危害极大的真菌毒素，多具有肝脏毒性、神经毒性、致癌性，并可能诱发免疫抑制类疾病[1-3]。爆米花作为一种很方便的零食，备受人们的喜爱。爆米花的食品安全问题越来越受到人们的关注。因此，建立爆米花中黄曲霉毒素、伏马毒素的检测方法非常必要。液相色谱串联质谱法作为较先进的检测技术，能提供化合物的分子结构信息，具有灵敏度高、能有效去除干扰等优势[4-7]。本研究建立了适用于同时分析爆米花中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFT B1）、黄曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFT B2）、黄曲霉毒素G1（Aflatoxin G1，AFT G1）、黄曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFT G2）、伏马毒素B1（Fumonitoxin B1，FB1）、伏马毒素B2（Fumonitoxin B2，FB2）和伏马毒素B3（Fumonitoxin B3，FB3）的超高效液相色谱-串联质谱法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液，中国计量科学研究院；伏马毒素B1、B2、B3混合标准溶液，青岛普瑞邦生物工程有限公司；同位素内标13C17-黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2（13C17-AFT B1、13C17-AFT B2、13C17-AFT G1、13C17-AFT G2），Romer国际贸易（北京）有限公司；13C34-伏马毒素B1、B2、B3（13C34-FB1、13C34-AFB2、13C34-AFB3），青岛普瑞邦生物工程有限公司；甲酸和乙腈，均为色谱纯，德国Merck公司；一级水。

1.2 仪器与设备

TSQ Altis超高效液相色谱-质谱联用仪，美国Thermo公司；ME204电子天平（精度0.1 mg），瑞士梅特勒-托利多公司；CR21N低温高速离心机，日本日立工机株式会社；Multi Reax混合器，德国海道夫公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

（1）标准储备液。将黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液用色谱级乙腈稀释至0.5 μg·mL-1；将伏马毒素B1、B2、B3混合标准溶液用色谱级乙腈稀释至10 μg·mL-1。

（2）混合真菌毒素同位素内标工作液。将各同位素内标标准溶液用乙腈稀释到所需浓度，其中13C17-黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2浓度为0.01 μg·mL-1，13C34-伏马毒素B1、B2、B3浓度为0.5 μg·mL-1。

（3）系列标准工作溶液。移取适量标准储备液，用20%乙腈-水溶液稀释成不同浓度点的标准工作系列。其中，黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2标准溶液的质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg·L-1和2.00 μg·L-1，伏马毒素B1、B2、B3标准溶液的质量浓度为1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg·L-1和40.0 μg·L-1。

1.3.2 样品前处理

称量5 g均质样品于50 mL离心管中，加入20 mL甲酸-水-乙腈（1∶29∶70，体积比），涡旋振荡30 min，以10 000 r·min-1离心5 min。分取0.5 mL上清于1.5 mL离心管中，加入1.0 mL水，旋涡混匀后，在4 ℃以10 000 r·min-1离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜。取180 μL处理好的样品滤液于300 μL内插管中，加入20 μL同位素内标混合溶液，混匀。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。流动相A：0.2%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：0.3 mL·min-1；进样体积：5 μL；色谱柱：Waters BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；梯度洗脱程序：0～1.0 min，流动相A维持在80%；1.0～4.0 min，流动相A从80%降低至60%；4.0～10.0 min，流动相A从60%降低至30%；10.0～11.8 min，流动相A从30%减至0%；11.8～15.0 min，流动相A从0%升至80%。

（2）质谱条件。锥孔电压：3.0 kV；加热器温度：500 ℃；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气：800 L·h-1。各真菌毒素及其同位素内标的质谱条件见表1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与检出限

将上述系列标准工作溶液上机测定，记录仪器响应值，以外标浓度与内标浓度比为横坐标，以外标峰面积与内标峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程与相关系数。以低浓度加标样品基线噪音的3倍信噪比计算方法检出限。由表2可知，7种真菌毒素在相应线性范围内，相关系数均大于0.999。

2.2 加标回收率和精密度

取阴性爆米花样品，分别向其中添加低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，实验重复6次，计算回收率及相对标准偏差。由表3可知，7种真菌毒素的平均加标回收率在72.5%～120.0%，相对标准偏差在2.04%～9.73%。

3 结论

本研究建立了同位素稀释-超高效液相色谱串联质谱法同时测定爆米花中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马毒素B1、B2、B3的检测方法。该方法的线性关系、检出限、精密度及准确度均符合标准要求，适用于对爆米花中7种真菌毒素的定量检测。

参考文献

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作者简介：王海萍（1985—），女，山东日照人，硕士，主管技师。研究方向：食品卫生检验。

通信作者：李慧（1977—），女，山东日照人，本科，副主任技师。研究方向：食品卫生检验。E-mail： lengli009@163.com。