超高效液相色谱-串联质谱法测定酵素梅中12种酚汀（酚丁）、酚酞及其酯类衍生物或类似物 

摘 要：目的：建立超高效液相色谱-串联质谱仪法测定酵素梅中非法添加的酚汀（酚丁）、酚酞及其酯类衍生物或类似物。方法：样品经水、甲醇超声提取，采用C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱分离，以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇为流动相，梯度洗脱，流速0.2 mL·min-1；通过ESI源（正离子）选择反应监测模式进行定性、定量监测。结果：12种非法添加组分在各自浓度范围内线性关系良好，相关性系数均大于0.997。在1倍检出限、2倍检出限、5倍检出限3种添加浓度下的平均回收率在93.0%～123.0%，精密度在0.26%～8.58%。结论：该方法灵敏度高、操作简单、测定快速，可用于酵素梅中12种非法添加药物的测定。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）；非法添加；酚丁；酚酞；酯类衍生物或类似物

Determination of 12 Oxyphenisatin， Phenolphthalein and Their Ester Derivatives or Analogues in Enzyme Plum by UPLC-MS/MS

LI Xiaofei

（Dalian Product Quality Inspection and Testing Institute Co.， Ltd.， Dalian 116023， China）

Abstract： Objective： To establish a ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of illegally added oxyphenisatin， phenolphthalein， and their ester derivatives or analogues in enzyme plum. Method： The sample was extracted by ultrasound with water and methanol， and separated using a C18 （50 mm×2.1 mm， 1.8 μm） chromatographic column. The mobile phase was 0.1% formic acid aqueous solution-0.1% formic acid methanol， with gradient elution at a flow rate of 0.2 mL·min-1; the detector selected a reaction monitoring mode for qualitative and quantitative monitoring using ESI source （positive ions）. Result： The results showed that the 12 illegally added components had good linear relationships within their respective concentration ranges， with correlation coefficients greater than 0.997. The average recovery rate of the three added concentrations of detection limit， 2-fold detection limit， and 5-fold detection limit is between 93.0% to 123.0%， precision between 0.26% to 8.58%. Conclusion： This method has high sensitivity， simple operation， and fast determination， and can be used for the determination of 12 illegal added drugs in enzyme plum.

Keywords： ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; illegal addition; oxyphenisatin; phenolphthalein; ester derivatives or analogues

酚汀（酚丁）、酚酞及其酯类衍生物或类似物均为临床上使用的缓泻剂，通过促排达到减肥的目的。这些药物一旦过量使用便会改变人体机能，造成人体器官衰竭。2023年10月国家市场监管总局发布了《关于打击食品中非法添加酚汀（酚丁）、酚酞及其酯类衍生物或类似物违法行为的通知》，列举了我国多地区查办的宣称“减肥”功能食品非法添加药品、药品衍生物或类似物系列案件，并指出在食品中检出酚汀（酚丁）、酚酞及其酯类衍生物或类似物（如4-氯双醋酚丁），均属于非法添加。

目前，检测非法添加化学药物的方法主要有高效液相色谱法[1]，液相色谱-三重四极杆质谱法[2-3]，液相色谱-高分辨质谱法[4]等。对于新型的非法添加化合物，国家补充检验方法有利用液相色谱-质谱联用法（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）对双醋酚丁进行定性及定量分析[5]，对于其他酚丁类化合物及衍生物现阶段没有国家标准或检测方法进行技术支撑，因此有必要尽早建立起酚汀（酚丁）、酚酞及其酯类衍生物或类似物的检测方法，为食品药品监管部门打击非法添加行为提供技术标准，以保障公众健康。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪（ESI源）；超声波清洗器；甲醇（色谱级）；乙腈（色谱级）；超纯水；甲酸（色谱级）、甲酸铵（色谱级）。

标准品：酚酞、百里香酚酞、双辛酚丁、4-氯双醋酚丁、双丙酚丁、双戊酚丁、4-氯酚丁、双丁酚丁、酚汀、双醋酚丁、双己酚丁、双庚酚丁，浓度为1 000 μg·mL-1。

混合标准溶液A（百里香酚酞浓度为10 mg·L-1、双辛酚丁浓度为5 mg·L-1，其余化合物浓度均为2 mg·L-1）：取百里香酚酞标准原液100 μL、双辛酚丁标准原液50 μL，其余各标准原液20 μL于同一容量瓶中（10 mL），用甲醇稀释定容至刻度。

混合标准曲线溶液：分别取混合标准溶液A 0.005、0.010、0.020、0.050 mL和0.100 mL于5个10 mL容量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，混匀。最终配制成百里香酚酞浓度为5、10、20、50、100 ng·mL-1；双辛酚丁浓度2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng·mL-1；其余化合物浓度为1、2、4、10、20 ng·mL-1的标准曲线工作溶液。

1.2 样品的前处理方法

称取样品1.00 g，置于10 mL刻度管中，加入2 mL水，涡旋混匀，再加入8 mL甲醇，超声提取30 min，放冷后，离心后2 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜后，供超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪测定。

1.3 UPLC-MS/MS条件

1.3.1 UPLC条件

色谱柱：C18（50 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；进样量：2 μL；流速：0.20 mL·min-1；流动相A：0.1%甲酸；流动相B：0.1%甲酸甲醇；流动相梯度：0～0.2 min，5% B；0.2～5.0 min，5%→15%B；5.0～10.0 min，15%→90% B；10.0～12.0 min，90%→100% B；12.0～13.0 min，100% B；13.0～13.5 min，100%→10% B，采集时间为16 min。

1.3.2 MS/MS条件

电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI），多反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM），正离子模式，毛细管电压：2.0 kV；锥孔反吹气：10 L·Hr-1；脱溶剂温度：450 ℃；离子源温度：150 ℃。定性离子对、定量离子对及其他质谱参数见表1。

1.3.3 结果计算

按外标法制作标准工作曲线，并据此得到样品中各化合物含量。样品中各化合物的含量计算公式如下。

（1）

式中：X为样品中各化合物的含量，μg·kg-1；C为上机待测液中各化合物的浓度，ng·mL-1；V1为最终定容体积，mL；m为试样的质量，g。

2 结果与分析

2.1 条件优化

2.1.1 质谱条件优化

将各化合物配制成浓度为100 ng·mL-1的单标溶液，采用针泵持续进样的方式，利用仪器自动调谐功能，依次对各化合物进行自动优化，得到各化合物的锥孔电压与碰撞能量的最佳参数，见表1。

2.1.2 液相色谱条件的优化

本实验采用实验室常用的甲醇、乙腈、甲酸水、甲酸铵水溶液的两两搭配作为流动相，对标准溶液进行液相色谱串联质谱仪的测定。结果发现，甲酸铵、乙腈同时使用时会对百里香酚酞、酚汀、双丁酚丁、4-氯双醋酚汀、双丙酚汀、4-氯酚丁、双醋酚汀有明显的抑制效应，使用0.1% 甲酸甲醇-0.1% 甲酸水体系时，12种化合物的色谱峰型良好，检测灵敏度较高，因此本实验选择0.1% 甲酸甲醇-0.1% 甲酸水作为流动相。

在优化的仪器条件下，12种化合物在14 min内均能得到较好的分离，有些非同分异构化合物保留时间接近，由于质荷比的不同，不影响定性与定量，各化合物定量离子扫描图见图1。

2.2 基质效应评价

基质效应是三重四极杆质谱法中影响定量结果准确性的重要因素。本研究对酵素梅样品基质进行研究，样品按本方法进行测定，12种化合物均为阴性，将其样品提取液作为空白基质溶液，用空白基质溶液和甲醇分别配制同浓度的混合标准溶液，上机测定，基质标准溶液和试剂标准溶液各平行测定3次，记录其各化合物的峰面积，求其平均值。相对基质效应=待测物在基质中的平均峰面积/待测物在纯溶剂中的平均峰面积×100%。

实验发现，在酵素梅样品基质中，12种化合物相对基质效应均在80%～125%，没有强基质效应的出现，又由于此类化合物均为非法添加物，在食品中不得检出，综合考虑，酵素梅样品的测定中可用溶剂曲线进行定量分析。

2.3 标准曲线

将1.1标准曲线溶液按上述方法进行仪器测定，以化合物浓度为横坐标，以化合物定量离子对的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线线性相关性系数r评价其相关性，各化合物的相关性系数如表2。结果符合《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》（GB/T 32465—2015）中相关性系数不小于0.997的要求。

2.4 方法检出限

在酵素梅样品空白基质中采用逐级递减的方法加入混合标准溶液，按本方法进行测定，以信噪比≥3作为依据确定各个化合物的检出限，最终确定百里香酚酞的检出限为50 μg·kg-1；双辛酚丁的检出限为25 μg·kg-1；其余化合物的检出限为10 μg·kg-1。

2.5 准确度与重复性验证

针对各基质，添加浓度分别在检出限、2倍检出限、5倍检出限的水平下，进行回收测定，12种化合物的回收率为93.0%～123.0%，各水平下的6平行样品加标回收率的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为0.26%～8.58%，各化合物在不同浓度的回收率及精密度详见表3。

2.6 提取溶剂的选择

本实验考虑12种酚汀（酚丁）、酚酞及其酯类衍生物或类似物在甲醇中溶解效率较高，又因为液相条件使用甲醇作为流动相，为增加溶剂匹配度，减小溶剂效应，所以使用甲醇作为提取试剂；加少量的水是因为有的样品水分较少，直接加入甲醇，样品分散性不好，提取效率低，所以先加少量水，使样品分散后加甲醇，保证方法的回收率。

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱仪法测定酵素梅中12种非法添加药物（包括百里香酚酞、双辛酚丁、4-氯双醋酚丁、双丙酚丁、双戊酚丁、4-氯酚丁、双丁酚丁、酚汀、双醋酚丁、双己酚丁、酚酞、双庚酚丁）的方法。经验证，该方法在基质效应、线性、检出限、回收率、重复性等方面均满足相关要求，并且其具有简单、快速、灵敏度高等优点，可作为检测酵素梅中非法添加12种药物的方法。

参考文献

[1]温家欣，陈林，赖宇红，等.高效液相色谱法同时快速测定凉茶中11种非法添加化学药物[J].分析测定学报，2016，35（3）：285-291.

[2]张高勤，赵丽红，冯斌，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定减肥及壮阳类食品中27种非法添加物[J].刑事技术，2023，48（2）：201-206.

[3]戴尽波，沈洁，董文静，等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法检测凉茶中59种非法添加化学药物[J].食品工业科技，2024，45（6）：242-253.

[4]孙婷婷，徐彦红，张雪梅，等.HPLC-ESI-QTOF-MS法测定减肥保健食品中16种食欲抑制剂[J].分析实验室，2019，38（12）：1449-1453.

[5]国家市场监督管理总局.食品中双醋酚丁等19种化合物的测定：BJS 202209[S/OL].（2022-09-10）[2025-01-20].http：//down.foodmate.net/standard/sort/9/126229.html.

作者简介：李肖斐（1986—），女，辽宁大连人，本科，高级工程师。研究方向：食品检测。