超高效液相色谱-串联质谱法检测保健品中的二氟拉松丙酸酯

Determination of Diflorasone Propionate in Health Products byUltra PerformanceLiquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

MA Xin， WU Junfa， PAN Zhiqi， QIN Yuxin （Guangzhou Inspectionand Testing Certification Group Co.，Ltd.，National Quality Inspection and Testing Center for Processed Food （Guangdong）， Guangzhou 511447， China）

Abstract： Objective： To establish an ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of diflurazone-17-propionateand diflulazone-2l-propionate in health products. Method： The samples were extracted by ultrasonication or vortexing of acetonitrile and 70% acetonitrile， eluted and separated by Waters BEH- ⋅C₁₈ column （100mm×2.1mm，3.0μm） ， and then determined by electrospray ionization source.Result： The linear relationship between the two diflularsone propionate esters was good in the range of 2.0～ 100.0μg⋅L^-1 ，and the correlation coefficient R²⩾0.9987. ，and the average recoveries were 72.3%～92.3% and the relative standard deviations were 4.43%～8.09% under the three spike levels.The limit of detection of solid tablets was 15μg⋅kg^-1 and the limit of quantification was 40μg⋅kg^-1 . The limit of detection and quantification of oil-based capsules was 30μg⋅kg^-1 and 100μg⋅kg^-1 .Conclusion： This method has short time， low solvent consumption， high recovery，sensitivity and precision，and can accurately analyze difulasone propionate in health care products.

Keywords： ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; health; simultaneous detection; diflulasone propionate

二氟拉松（Diflorasone）及其酯类作为一种高效的皮质类固醇激素制剂，展现出卓越的抗炎、抗瘙痒特性，同时兼备显著的免疫抑制与缩血管功能，因此在医学领域中被广泛应用于治疗多种顽固性与复杂性皮肤病[1-2]，为患者提供了有效的缓解与治疗方案，显著改善了患者的皮肤健康状况。目前，二氟拉松在保健品范畴内的长期使用安全性尚缺乏充分评估。若长期或过量摄入，可能诱发皮肤萎缩、褶皱形成、毛囊炎以及痤疮等一系列不良皮肤反应[3-5]，从而违背保健品保障健康的初衷。

对于皮质类固醇激素的测定方法主要有液相色谱法[6-7]、液相色谱－串联质谱法[8-10]。其中，液相色谱法检测成本低，但分离难度大、耗时较长，且谱图容易受到杂质峰的干扰，影响分析效果，方法整体灵敏度普遍较低，对于含量为ppb级别的样品难以检出。基于此，本研究建立了采用超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra-PerformanceLiquidChromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）测定保健品中二氟拉松-17-丙酸酯和二氟拉松-21-丙酸酯的方法，旨在为后续二氟拉松的系列化合物测定提供技术参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

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二氟拉松 -17- 丙酸酯、二氟拉松-21-丙酸酯标准品：纯度大于 98% ，上海安谱实验科技股份有限公司；甲酸、甲醇、乙腈、正己烷及乙酸乙酯：色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司。

1.2仪器与设备

SCIEX 5500+ 液相色谱-串联质谱仪：美国SCIEX公司；LC-30AD液相色谱系统：日本岛津公司；Milli-QAdvantageA10超纯水系统：法国默克密理博公司；4k-15高速离心机：德国西格玛公司；KQ-800DB超声波清洗仪：昆山超声仪器有限公司；MultiReax涡旋振荡器：德国海道夫公司。

1.3标准溶液的配制

标准储备液：准确称取二氟拉松-17-丙酸酯、二氟拉松-21-丙酸酯标准品各 10mg ，分别置于10mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，制成 1000mg^-L^-1 标准储备溶液。

混合标准溶液：准确移取二氟拉松-17-丙酸酯、二氟拉松-21-丙酸酯标准储备液适量，用乙腈配制得到质量浓度为 10mg⋅L^-1 的混合标准储备溶液。

标准工作曲线：使用空白基质提取液稀释混合标准溶液，配制浓度为 2.0，5.0，10.0，20.0，50.0μgL^-1 和 100.0μg⋅L^-1 的系列标准溶液。

1.4 前处理方法

（1）固体保健食品。样品粉碎过80目筛，备用。称取 0.5g 样品于 50mL 离心管中，加入 10mL 乙腈，涡旋振荡 1min 。超声提取 20min ， 10 000r⋅min^-1 离心 5min 。上清液经 0.22μm 滤膜过滤，滤液作为供试品用UPLC-MS/MS测定。

（2）油基保健食品。称取 0.2g 样品于 50mL 离心管中，加入 2mL 正己烷，涡旋分散均匀后，加入5mL 的 70% 乙腈，涡旋振荡 3min ， 10 000r⋅min^-1 离心 5min ，吸取下层溶液至 10mL 具塞比色管中，上层正己烷层用 5mL 的 70% 乙腈溶液重复提取一次，合并两次溶液，加 70% 乙腈溶液定容至刻度，混匀，经 0.22μm 滤膜过滤后，滤液作为供试品用UPLC-MS/MS测定。

1.5 测定条件

1.5.1 色谱条件

Waters BEH- ⋅C₁₈ 色谱柱（ 100mm×2.1mm ，3.0μm ）；流动相A为 0.1% 甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为 0.3mL⋅min^-1 ；色谱柱柱温： 40% ：进样量： 5μL ；洗脱方式：梯度洗脱。洗脱程序： 0～ 4.0min ， 70%20%A ； 4.0～7.0min ， 20% 0%A ： 7.0～9.0min ， 0%A ： 9.0～9.5*min ， 0%70% A； 9.5～13.0min ， 70%A 。

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；监测模式：正离子多反应监测模式（MultipleReactionMonitoring，MRM），监测离子对及相关参数见表1。电喷雾电压：5500V ；气帘气压： ；雾化气压力： 50psi 辅助气压力： 50psi ；离子源温度： 500°C 。

2 结果与分析

2.1测定条件及参数的确定

用乙腈配制 1mg⋅L^-1 的混合标准溶液，使用直接注射的方式注入离子源，对母离子形态进行初步扫描。结果发现，两种二氟拉松丙酸酯在正和负离子模式下均有响应，而正离子模式的响应比负离子更强，其中加氢模式的响应大于加铵和加钠，因此最终选择 [M+H]⁺ 为母离子，同时在流动相中加入甲酸，以促进离子化。两种二氟拉松丙酸酯的提取离子流图见图1。

2.2不同溶剂回收率考察

使用甲醇、乙腈、乙酸乙酯以及不同比例的乙腈溶液对不同的基质样品进行提取，考察不同溶剂对回收率的影响。油基基质因为油的干扰，提取难度较大，回收率相对固体样品也较低，因此需要使用乙腈水作为溶剂提取，以此来提高提取溶液的极性，从而减少脂溶性杂质的提取。由表2可知，对于固体片剂样品，乙腈的回收率明显比甲醇和乙酸乙酯高，说明两种二氟拉松丙酸酯的极性和乙腈最接近。对于油基胶囊样品来说，纯甲醇和纯乙腈的提取效果明显较低，进一步使用不同比例的乙晴溶液进行提取，发现 70% 的乙腈溶液对目标物的回收率最高，因此最终使用该比例对油基样品进行提取。

2.3提取方式的选择

实验进一步对比了超声提取、涡旋振荡提取和水平振摇提取3种提取方式对目标物质回收率的影响。由表3可知，对于固体片剂，超声提取的回收率最高，涡旋振荡与之相当；油基胶囊由于体系中分为液液两相，超声方式难以使其充分混合，故涡旋振荡的提取效率更佳。最终选择超声提取方式提取固体片剂样品，涡旋振荡的方式提取油基胶囊样品。