高效液相色谱法测定婴幼儿羊奶粉中的香兰素

作者: 张丽

高效液相色谱法测定婴幼儿羊奶粉中的香兰素0

作者简介:张丽(1988—),女,江苏南通人,本科,助理工程师。研究方向:食品分析。

摘 要:利用高效液相色谱仪建立一种快速、简便、确度高的测定方法来检测婴幼儿羊奶粉中的香兰素含量。样品经乙醇提取后,漩涡振动,快速离心后经微孔滤膜过滤,使用Supersil AQ C18柱分离,并将甲醇-水溶液作为流动相进行梯度洗脱,在278 nm的波长下进行检测,通过外标法定量。结果表明,在0.5~

50.0 μg·mL-1呈现良好的线性关系,线性系数为0.999 8,加标回收率为96.44%~104.17%,相对标准偏差为3.30%~4.63%,香兰素的检出限为0.17 μg·mL-1、定量限为0.51 μg·mL-1。

关键词:高效液相色谱法;香兰素;婴幼儿羊奶粉

Determination of Vanillin in Goat Milk Powder for Infants by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Li

(Shanghai Deno Product Testing Service Co., Ltd., Shanghai 200436, China)

Abstract: A rapid, simple and accurate method for the determination of vanillin in infant sheep milk powder was established by high performance liquid chromatography. The samples were extracted by ethanol, swirled, centrifuged rapidly, filtered by microporous filter membrane, then separated by Supersil AQ C18 column, and gradient elution was performed with methanol-aqueous solution as mobile phase. The samples were detected at a wavelength of

278 nm and quantified by external standard method. The results showed that the linear range of vanillin standard curve was 0.5~50.0 μg·mL-1, the linear coefficient is 0.999 8, the recoveries were 96.44%~104.17%, and the relative standard deviations were 3.30%~4.63%, the limit of detection of vanillin was 0.17 μg·mL-1 and the limit of quantitation was 0.51 μg·mL-1.

Keywords: high performance liquid chromatography; vanillin; goat milk powder for infants

香兰素,又名香草醛,为一种广泛使用的可食用香料[1],带有香荚兰豆芳香和浓郁奶香,最早从兰科植物香荚兰中被发现。香兰素为白色或浅黄色针状或结晶状粉末[2],微溶于水,易溶于有机试剂,可用作定香剂、协调剂及调味剂。但是,过量摄入香兰素会对人体健康产生负面影响[3],甚至会对婴儿的肝脏和肾脏造成不可逆转的损害[4]。另外,6个月以下的婴儿食用含香兰素的婴幼儿羊奶粉可能会影响他们的胃口。香兰素香甜的味道会使婴幼儿对其形成依赖性[5],还可能导致婴幼儿产生偏食、厌食及挑食等不健康的饮食习惯。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760—2014)中规定,

0~6个月婴儿配方食品中不得添加任何食用香料,较大婴儿和幼儿配方食品中可以使用香兰素、乙基香兰素和香荚兰豆浸膏,最大使用量为5 mg/100 mL。2025年2月即将实施的《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760—2024)对于婴幼儿食品规定完全不允许使用任何香精香料。鉴于此,建立快速、准确、灵敏的检测方法测定婴儿配方奶粉中香兰素的含量具有重要的现实意义,可为婴幼儿食品质量控制及食品安全监管提供一定的科学依据。

香兰素的含量测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、超高效液相色谱-串联质谱法(Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS)、气相色谱-质谱法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)及电化学方法等。例如,孟德素等[6]利用紫外分光光度法同时测定香兰素和水杨酸。杨丽霞[7]利用紫外分光光度法对饼干中的香兰素含量进行测定,紫外分光光度法成本低,仪器设备易操作,但灵敏度较低。谢晓丹[8]采用HPLC测定脱石散中的香兰素含量,这一方法快速、高效,更适用于测定一些基质比较简单的食品或者饮料中的香兰素含量。詹胜群等[9]采用UPLC-MS/MS快速筛查婴幼儿配方乳粉中3种香兰素的污染情况。UPLC-MS/MS具有操作简单、灵敏、准确、可靠等优点,但存在设备维护成本高、操作周期长、操作条件要求高等问题。郑璇等[10]利用GC-MS实现奶粉中香草醛、乙基香草醛的同步检测,该方法简单、快速,选择性强,但操作复杂,需要反复提取浓缩。HAREESHA等[11]制备出一种高性能石墨复合膏体传感器,然后采用电化学阻抗谱(Electrochemical Impedance Spectroscopy,EIS)测定食品样品中的香兰素。ZIYATDINOVA等[12]制备出一种电聚合溴甲酚紫沉积的传感器,利用该传感器对食品中香兰素含量进行检测。本文参考已有研究,利用高效液相色谱仪建立一种快速、简便、确度高的测定方法来检测婴幼儿羊奶粉中香兰素的含量

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Agilent 1260 液相色谱仪(紫外检测器)、VM-96A涡旋振荡器,上海沉汇仪器有限公司;武汉恒信HX-10型10 L超声波清洗器,武汉恒信世纪科技有限公司;TH-15离心机,合肥艾本森科学仪器有限公司;0.45 μm微孔滤膜。

香兰素标准品(纯度≥98%),天津市众联化学试剂有限公司;甲醇、乙腈、正己烷,色谱纯,国药试剂;乙醇,分析纯,国药试剂;二次蒸馏水作为实验用水;6个品牌一至三段婴幼儿羊奶粉样品(共计18份),均购自电商平台。

1.2 实验方法

1.2.1 香兰素对照品溶液的制备

准确称量1.250 1 g香兰素标准品,用乙醇进行充分溶解,转移至250 mL容量瓶内,用乙醇定容,配制成50 μg·mL-1标准溶液,放置于低温黑暗环境中保存。取适量该溶液进行稀释,制成0.5 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1系列标准工作液。

1.2.2 婴幼儿羊奶粉样品溶液的制备

①准确称取婴幼儿羊奶粉2 g放入试管中,加入25 mL常温二次蒸馏水,使用超声波清洗器对试样进行振动处理10 min,使其充分混合均匀和溶解。②利用涡旋振荡器对试样进行振荡处理40 s,移取均匀溶液10.00 mL放入离心管,加入5 mL乙醇,使用涡旋振荡器对溶液振荡40 s后离心8 min,上层的清液被收集于容量瓶中。③向容量瓶中加入等量乙醇,同样的条件下继续操作1次,合并两次的上清液转入同一容量瓶,用乙醇进行定容后充分混合,之后经生物膜过滤后获得样品溶液。

1.2.3 色谱条件

色谱柱为Supersil AQ C18柱;流动相用甲醇-水梯度洗脱,洗脱程序见表1,经0.45 μm微孔滤膜过滤;流速1.0 mL·min-1;检测波长278 nm;柱温30 ℃;进样量10 μL。

表1 洗脱程序

时间/min 甲醇/% 水/%

0 10 90

8 30 70

18 80 20

2 结果与分析

2.1 检测波长选择

利用Agilent 1260 液相色谱仪(紫外检测器)对200~400 nm波长的香兰素标准中间液进行扫描,设置纵横轴分别为吸光度和波长,对数据进行可视化处理后得到吸收波长图,共有3处吸收峰是香兰素的吸收峰,分别为230 nm、278 nm、309 nm。进一步对比分析发现,230 nm处的峰形与敏感性虽好,但对应的干扰很明显,因而选择其他两个吸收峰对应的波长为检测波长。同时,测定发现,278 nm的吸收峰峰形对称度更高,干扰小。因此,最终确定检测波长为278 nm。

2.2 流动相选择

对比甲醇-水和乙腈-水作为流动相时的检测效果,结果发现,香兰素在两种流动相中的色谱保留性能和峰响应强度均较好。其中,香兰素在甲醇-水体系中能更快体现高强度峰响应,所以选定甲醇-水体系为本实验的流动相。

2.3 净化条件优化

婴幼儿羊奶粉经乙醇溶剂提取后,还含有少量脂肪,为了减轻油脂对测定结果的影响,选择正己烷作为净化溶剂。取用乙醇2 mL,分别加入正己烷0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL使之纯化。结果发现,加入正己烷0.5 mL纯化后,再次进行离心过滤,可以有效净化脂肪。同时,样品在预处理过程中没有受到其他杂质的干扰,纯化效果较好。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围

对香兰素标准工作溶液进行测定,以香兰素浓度为横坐标,以色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果显示,在0.5~50.0 μg·mL-1浓度范围内,线性关系良好,线性方程为y=48 429x-265.96,相关系数为0.999 8。

2.4.2 检出限、定量限试验

在3倍信噪比的进样浓度水平下计算得出,检出限为0.17 μg·mL-1;在10倍信噪比的进样浓度水平下计算得出,定量限为0.51 μg·mL-1。

2.4.3 加标回收率

向空白奶粉样品基质中分别添加5 mg·kg-1、

10 mg·kg-1和100 mg·kg-1 3个加标水平的香兰素标品,平行测定6次,计算回收率及相对标准偏差,结果见表2。

2.5 实际样品测定

采用所建立的方法对6个品牌的18个婴幼儿羊奶粉中香兰素的含量进行检测。结果显示,6个品牌的一段奶粉均未检出香兰素,符合GB 2760—2014对0~6个月婴儿乳粉无香精香料添加的限定;6个品牌的二段奶粉中有1个品牌检测出香兰素,含量为12.27 mg·kg-1;6个品牌的三段奶粉中有4个品牌检测出香兰素,含量为27.11~39.25 mg·kg-1。虽然检出量并未超过现行标准GB 2760—2014,但考虑到2025年2月即将实行的GB 2760—2024不允许添加任何香精香料类产品,相关生产企业应及时调整工艺流程,杜绝添加香兰素及其他香精香料。

3 结论

本研究优化了色谱检测时Agilent 1260 液相色谱仪(紫外检测器)的波长选择条件,确定了278 nm处的波长为最佳检测波长;考察了不同流动相的分离效果,确定了甲醇-水为流动相,香兰素可被有效分离;确定了0.5 mL正己烷可有效净化奶粉中的脂肪,最终建立了一种利用HPLC测定婴幼儿羊奶粉中香兰素的快速检测方法。HPLC用于婴幼儿羊奶粉中香兰素的测定具有较好的应用价值,可为婴幼儿羊奶粉的安全性评价提供有力的技术支撑。

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