液相色谱串联质谱内标法测定猪肉中沙丁胺醇的不确定度分析
作者: 杨翠
摘 要:目的:通过液相色谱串联质谱内标法测定猪肉中沙丁胺醇的含量,探究检验过程中的影响因素,并计算各因素的不确定度,为准确测定沙丁胺醇含量提供科学指导。方法:按照《化学分析中不确定度的评估指南》(CNAS—GL06:2019)、《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059.1—2012)和《食品安全国家标准动物性食品中β-受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(GB 31658.22—2022),分析不确定度来源。结果:样品测定值为28.3 μg·kg-1,取置信区间为95%,扩展不确定度为4.477 μg·kg-1(k=2)。结论:通过对仪器设备、样品制备、标准品及内标、样品重复性测定和温度等因素的评估计算,结果发现高效液相色谱仪串联质谱仪、标准曲线配制、内标物质纯度对检测结果的影响较大,在实际测量过程中,严格控制实验条件可提高检测的可靠性、准确性。
关键词:液相色谱串联质谱法;不确定度;猪肉;检测;沙丁胺醇
Uncertainty Analysis of Salbutamol in Pork by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry with Internal Standard Method
YANG Cui
(Ganzi Institute of Food and Drug Inspection, Ganzi 626000, China)
Abstract: Objective: To determine the content of salbutamol in pork by liquid chromatography tandem mass spectrometry internal standard, explore the influencing factors in the testing process, and calculate the uncertainty of each factor, in order to provide scientific guidance for the accurate determination of salbutamol content. Method: Sources of uncertainty were analyzed according to CNAS—GL06:2019, JJF 1059.1—2012 and GB 31658.22—2022. Result: The sample was measured at 28.3 μg·kg-1, the confidence interval was 95%, and the extended uncertainty was 4.477 μg·kg-1(k=2). Conclusion: Through the evaluation and calculation of factors such as instrument equipment, sample preparation, standard and internal standards, sample repeatability determination, and temperature, it was found that high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, standard curve preparation, and internal standard substance purity have a significant impact on the detection results. In the actual measurement process, strict control of experimental conditions can improve the reliability and accuracy of detection.
Keywords: liquid chromatography tandem mass spectrometry; uncertainty; pork; detection; salbutamol
沙丁胺醇(Salbutamol)属于一种具有选择性的β受体激动剂,能进行性激动支气管平滑肌的β受体的选择,扩张支气管[1-3]。临床上常用于预防治疗支气管哮喘[4]。饲喂畜禽沙丁胺醇能够加快畜禽的骨骼肌发育速度,减少脂肪沉积[5]。我国对莱克多巴胺、盐酸克伦特罗的用途予以合法约束之后,部分不法商户会将沙丁胺醇作为替代品用于畜禽饲喂[6]。如果促生长饲料内的沙丁胺醇含量超出正常治疗量,那么动物体内会残留一定的沙丁胺醇,而人们食用有沙丁胺醇残留的动物食品后,会出现中毒反应[7]。目前,应用相对较为广泛的沙丁胺醇残留检测方法主要有气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法等[8-10]。
质谱分析法是通过测定被测样品离子质荷比进行分析[11],液相色谱串联质谱仪由接口装置、高效液相色谱、质谱仪组成,其作用是先分离混合物样品,再进入质谱仪[12]。液相色谱串联质谱是检测沙丁胺醇的较为高效的检测方法[13],这种检测方法不涉及衍生化环节,利用液相色谱可以有效分离出部分热不稳定小分子极性物质,质谱能精准检测其中的化合物[14]。部分检测中运用液相色谱串联质谱法对动物肝脏中沙丁胺醇含量进行综合检测分析,通过检测得出其平均回收率为76%,不同样品之间的相对标准偏差为6%[15]。孙雷等[16]综合阐述了检测分析动物源食品中沙丁胺醇的多种方法,发现食品中沙丁胺醇含量极值为0.1 μg·kg-1。蔡欣欣等[17]结合内标法对动物源食品进行检测分析,主要测定了沙丁胺醇含量,得出其最低定量限为0.2 μg·kg-1。朱英才等[18]通过超高效液相色谱-串联质谱法综合检测分析猪尿内的沙丁胺醇残留量,沙丁胺醇回收率为93.8%,最低定量限为0.27 μg·L-1。谷旭等[19]运用超高压液相色谱-飞行时间质谱法检测分析了猪尿液和相关代谢物内的沙丁胺醇含量,运用乙腈对猪尿样品进行处理,在样本中沙丁胺醇的保留时长可达1.8 min,沙丁胺醇特征离子对应的质荷比达240,沙丁胺醇进入猪体内之后
6 h内的尿液中检测分析出的代谢产物相对较多,结果显示发现了5种不同的代谢产物,其中2种代谢产物在以往的报道中未发现[20]。液相色谱串联质谱法具备样品用量少[21]、灵敏度高[22]、选择性强[23]等多种优势,成为现阶段开展沙丁胺醇测定的主要方法之一。基于此,此次主要按照《测量不确定度评定与表示》
(JJG 1059.1—2012)以及《化学分析中不确定度的评估指南》(CNAS—GL06:2019)的规定,分析了液相色谱串联质谱内标法测定猪肉中沙丁胺醇的不确定度。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇(LC-MS级),购自山东夸克化工有限公司;β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶,购自美国Sigma-Aldrich公司;乙酸钠(优级纯),购自湖北万得化工有限公司;高氯酸(优级纯),购自金川县金星氯酸盐厂;甲酸,购自美国Fisher科学世界公司;氨水(优级纯),购自河北正坤精细化工有限公司;氢氧化钠(优级纯),购自上海巨鹏化工科技有限公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪串联质谱仪(安捷伦1290-6470),ESI+ Agilent Jet源;安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm);梅特勒电子天平XS205DU;Oasis MCX阳离子交换柱,60 mg/3 mL;TurboVap氮吹仪,瑞典Biotage仪器设备公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品前处理
称取2 g(精确到0.01 g)完全捣碎的样品并放置到规格为50 mL的塑料管内,在塑料管中倒入8 mL的乙酸钠缓冲液,使其均匀混合,放入β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶,剂量为50 μL,混匀,放置于37 ℃的水浴中水解,时间设定为12 h。把100 μL剂量规格为10 ng·mL-1的内标工作液倒至待检测样品中。塑料管加盖后放入水平振荡器内,时间设定为15 min。放入转速为5 000 r·min-1的离心机内,时间设定为10 min。取4 mL离心后的上清液,放入5 mL浓度为0.1 mol·L-1的高氯酸溶液,混匀,在液体内放入一定量的高氯酸,将液体pH值调整到1±0.3。设定离心机转速为5 000 r·min-1,时间设定为10 min,取出离心后的所有上清液,放置于规格为50 mL的离心管内,放入一定量的10 mol·L-1的氢氧化钠溶液,把试管内液体pH值调整到11。在溶液中加入饱和氯化钠溶液、异丙醇-乙酸乙酯混合溶液各10 mL,待其完全提取后,放入转速为5 000 r·min-1的离心机内,时间设定为10 min。40 ℃水浴,并通过氮气,使其干燥。放入5 mL乙酸钠缓冲液,样品溶液超声混匀,全部溶解残渣部分并留作备用。
把阳离子交换小柱以及真空过柱装置连接到一起,把残渣溶液加入真空柱中,分别用2 mL水、2%甲酸水溶液、甲醇3种不同液体对柱子进行洗涤,洗涤后及时抽干洗涤液体,利用5%氨水甲醇溶液完全清除柱子内留存的部分待测成分。在洗脱过程中,应将流速控制在0.5 mL·min-1。将洗脱液放置于
40 ℃水浴中并且利用氮气使其干燥。在样品溶剂中加入200 μL规格为0.1%的甲酸/水-甲醇溶液(95+5)并对其进行超声混匀,把溶液移至1.5 mL离心管内,放入转速为5 000 r·min-1离心机内,时间设定为
10 min,对离心后的上清液进行液相色谱串联质谱测定。
1.3.2 标准溶液配制
配制规格为1 000 mg·L-1的沙丁胺醇标准储备溶液,精准称取0.009 21 g的沙丁胺醇,溶解,溶液容积设定为50 mL,于4 ℃贮存,保存期为6个月。配制沙丁胺醇-D3混合标准中间溶液(100 mg·L-1),精准量取1 mL丁胺醇标准储备溶液,放入规格为
100 mL的容量瓶内,用甲醇定容。配制5 ng·L-1的沙丁胺醇溶液,试剂配制浓度测定值为4.832 1 ng·L-1、4.867 1 ng·L-1、4.864 4 ng·L-1,基质配制测定值为
5.438 2 ng·L-1、5.504 5 ng·L-1、5.441 6 ng·L-1。
1.3.3 数学模型
待检测样本内的沙丁胺醇残留量的计算公式为
(1)
式中:X为待检测样本内的沙丁胺醇残留量,μg·kg-1;c为配制的标准工作溶液中的沙丁胺醇浓度,ng·mL-1;csi为标准工作溶液中含有的内标物浓度,ng·mL-1;ci为样品中的内标物浓度,ng·mL-1;A为样品内的沙丁胺醇能够形成的峰面积;Asi为标准工作溶液内的内标物能够形成的峰面积;Ai为样品内的内标物能够形成的峰面积;As为标准工作溶液内所含沙丁胺醇能够形成的峰面积;V为样品的定容体积,mL;m为样品的称样量,g。
2 结果与分析
2.1 标准物质定容及稀释过程中引入的不确定度
2.1.1 标准品定容引入的不确定度
在标准储备液(182.911 mg·L-1)配制中,容量瓶定容误差会引入不确定度。容量瓶规格50 mL,容量瓶允差为±0.05 mL,结合三角分布,其标准不确定度为
将温度引入不确定度中,校准容量瓶所需温度设定为20 ℃,而实验室内温度通常控制在(20±2)℃,受到水膨胀系数(2.08×10-3 ℃-1)影响,假定温度变化为均匀分布,则对应的标准不确定度为
定容引入的不确定度为
标准品定容引入的相对标准不确定度为
2.1.2 标准溶液稀释引入的不确定度