乳果糖酶法制备工艺研究进展

乳果糖是由半乳糖和果糖以β-1，4-糖苷键连接而成的二糖，化学式为C12H22O11，是乳糖的异构化产物。市售乳果糖多为微黄色透明糖浆，具有甜味（蔗糖的60%-80%）、水溶性。此外，与乳糖相比，乳果糖具有更高的甜味和醇溶性，并且在酸热条件下具有高稳定性，这一特点可使其用作酸性食品的益生元补充剂。乳果糖天然存在，可在加热牛乳过程中产生，但含量甚微。服用后，可不被胃酸消化分解直达小肠，经肠道微生物发酵产生短链脂肪酸（主要为乙酸、丙酸、丁酸），降低肠道微生态PH，改善肠道微生态，促进益生菌生长，抑制有害菌，并且具有润肠通便等功效。在医学上，乳果糖经常被用来肝性脑病、便秘和腹泻等疾病的治疗，且安全性高，无任何负面作用。

乳果糖的制备方法主要有三类：化学异构法、电活化技术、酶法。化学异构法具有转化率高、操作简便等特点，是目前唯一工业化的乳果糖制备方法。其原理为乳糖在强碱性条件下发生Lobry-de Bruyn-van Ekenstein反应，使其结构中的葡萄糖基团异构成为果糖基团。硼酸是该法中最常用且转化率最高的催化剂，但硼酸的大量添加也使得后续精制过程的难度急剧增加，这是限制乳果糖制备规模增加的一个重要原因。电活化技术是一种新兴的乳果糖制备技术，具有安全、环保、清洁、绿色等特点。该反应在施加电场的反应器中进行，施加电场后，阴极一端将产生适于乳果糖异构的强碱性条件，且无需加入催化剂，降低了后续脱盐和纯化工序的难度，但仍存在于转化率较低的问题。酶法合成乳果糖一般条件温和，被认为是一种可克服化学法合成局限性和问题的友好替代方法，糖苷水解酶和纤维二糖差向异构酶是两种被报道可用于制备乳果糖的两种酶。本文综合目前已有报道，对乳果糖酶法合成工艺研究进展做出综述。

1.β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）可催化乳糖水解为半乳糖和果糖，该酶在催化乳糖水解的过程中还伴随着转苷反应，生成乳果糖。β-半乳糖苷酶法是第一个被发现可用于制备乳果糖的生物酶，存在多种来源，包括嗜热古细菌、矿硫化叶菌、黑曲霉、克鲁维酵母等。其合成机理可具体解释为β-半乳糖苷酶利用乳糖和D-果糖为底物，通过转苷反应，解离出1分子D-葡萄糖后的半乳糖基团再通过缩合1分子D-果糖而形成乳果糖，最终产物包括乳果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖等。20世纪70年代末，Vaheri和Kaupinnen使用脆壁酵母（Saccharomyces fragilis）来源的β-半乳糖苷酶催化乳糖的转苷反应，乳果糖的产量仅为7.8g/L，得率约为3%。2009年，有研究显示，米曲霉来源的β-半乳糖苷酶具有较高的转苷活性，制备的乳果糖含量约为65g/L，但该法由于转化率低和后续纯化难度大等原因而无法大规模应用。

2.β-葡糖苷酶

20世纪末，有研究发现来源于强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）的β-葡糖苷酶具有与β-半乳糖苷酶类似的转苷活性，可催化转苷反应用于制备乳果糖。在随后的研究中，研究人员又将乳果糖的产量提升到了15.0g/L。由此可见，β-葡糖苷酶虽具有转苷特性，但其活性较低，转化率同样较低。因此，β-葡糖苷酶并未引起业界的广泛关注。

3.纤维二糖差向异构酶

纤维二糖差向异构酶在厌氧瘤胃细菌白色瘤胃细菌（Ruminococcus albus）的培养液中被首次发现，随研究的深入，多种来源的纤维二糖差向异构酶被发现，包括溶纤维真细菌（Eubacterium cellulosolvens）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）等。纤维二糖差向异构酶具有差向异构作用，可以β-1，4-糖苷键连接的纤维二糖、乳糖、D-葡萄糖等为催化底物，并作用于该类低聚糖的还原末端，生成差向异构体，同时又能将醛糖异构化为酮糖。研究报道，纤维二糖差向异构酶可以乳糖为唯一底物制备乳果糖，在适当条件下可将乳果糖转化率提升至58%，乳果糖浓度高达406g/L，并且该体系中添加硼酸可将乳果糖转化率进一步提升至88%，此时反应体系中乳果糖浓度为616g/L。由此可见，纤维二糖差向异构酶是目前已有报道中最为高效合成乳果糖的酶，其转化率可与化学方法相当。与此同时，纤维二糖差向异构酶还具有安全性高、无须添加多余底物、产物精制较为便捷等特点。因此，该酶具有工业化应用潜力。但纤维二糖差向异构酶同样具有弊端，即当温度升高至80℃时，该酶表现出热稳定性差等特点，这一弊端也局限了其大规模应用。

此外，使用纤维二糖差向异构酶还可能会导致副产物依匹乳糖含量过高的问题，而各国药典和法律法规等则对其含量做出严格限制。因此，通过蛋白质工程对纤维二糖差向异构酶进行改造以降低依匹乳糖产量是一可行思路，也愈加吸引各国学者的目光。Shen等使用定向进化并对突变体进行筛选后得到了不产生依匹乳糖的五位突变体。Park等首先分析了纤维二糖差向异构酶酶活性中心与甘露糖基团C-2的相互作用原理，随后选择两个关键的残基位点进行饱和突变，得到新的突变体，使用该突变体制备乳果糖可得到43.5%的转化率。Shen等则对纤维二糖差向异构酶的热稳定性进行了研究，结果显示，双位点突变可使酶在高温下的活性半衰期提高4倍，最适反应温度提高7.5℃，底物催化效率提升29%。目前，相关研究尚不完善，但蛋白质工程极具潜力，是一个较好的突破方向。

4.酶固定化技术

酶的催化过程具有高效和专一等特点，但部分酶离开特定环境往往产生稳定性差和不可重复利用等不利于生产的现象。因此，酶固定化技术愈加吸引人们的关注。酶固定化技术起源于20世纪初。1916年，Nelson等发现蔗糖酶可吸附在氧化铝和焦炭上，并且仍然可以发挥催化作用。1969年，日本田边制药公司将米曲霉源氨基酰化酶固定化，并且在L-蛋氨酸生产中得到成功应用。这也是世界首例工业化应用的固定化酶。1971年，国际酶工程第一届会议提出固定化酶概念，即经过物理或化学方法处理，使得酶限定在某些固定的区域，保持其催化活性，并且可重复利用的酶。

固定化酶在稳定性（pH稳定性、温度稳定性）、重复利用性、产物后续处理以及经济性方面具有无可比拟的优越性。目前，酶的固定化技术由传统的吸附法、共价结合法、包埋法、交联法等向新型载体固定化技术（辐射处理固定法、光化学固定法、等离子体固定法和电化学聚合固定法）、无载体固定化酶技术（交联溶解酶（CLDEs）、交联酶晶体（CLECs）、交联酶聚集体（CLEAs）和交联喷雾干燥酶（CLSDs）以及定向固定化技术方向发展，而固定化酶载体随着固定化技术研究的深入由传统的物理吸附载体、共价连接载体、截留载体以及胶囊包埋载体等向磁性载体、纳米材料载体、环境敏感性载体以及导电载体等新型载体材料方向发展。Wang等将纤维二糖差向异构酶固定于Duolite A568树脂上，经吸附和交联等完成固定，性能表征结果显示，该固定化酶在50℃条件下，其活力可维持12h不受损失；在70℃条件下，反应15批次仍然可以保留90%酶活。可见，该固定化酶具有一定的应用价值。此外，还可采用固定化细胞技术。Gu等使用枯草芽孢杆菌作为固定化载体，负载量1.47mg/1011个芽孢，负载率为79.4%，并使用该固定化酶进行乳果糖的制备，产量可达395g/L，转化率达到56.4%，生产强度98.75g/（L·h），反复使用8 批次后可保留70%酶活。

结语

乳果糖具有多种优异的生理功能特性，已经在临床医药行业、食品行业和动物饲料行业等领域得到了广泛应用。目前，乳果糖的年世界产量超过60000t，荷兰苏威公司和日本森永乳业公司是两大乳果糖生产企业。自乳果糖问世以来，乳果糖在人们日常生活中的应用越来越广泛，这也对乳果糖的制备技术提出更高要求，各国学者和企业也在不断推陈出新，旨在建立更安全、更环保、更高效、更节能的乳果糖制备技术体系。

目前，对乳果糖制备生产的研究主要集中于生产工艺、纯化精制、功能研究以及高酶活性微生物筛选等方面。在工艺上，目前的关注点主要集中在提高酶的使用寿命和稳定性以及后续精制纯化过程。对于提高酶的使用寿命和稳定性方面，固定化酶技术是一个主要的发展趋势。在精制纯化方面，目前的生产工艺往往导致产品中副产物或底物等含量过高，包括蔗糖、葡萄糖、乳糖和依匹乳糖等。这些物质在理化性质等方面和乳果糖存在一定的相似性，因此也导致了分离纯化过程的难度和成本增加，极大地限制了乳果糖产业化和工业化的发展。色谱分离技术是当前主要的分离纯化技术，在进行色谱分离纯化前，首先应考虑除去多量的乳糖，否则将产生乳糖结晶析出堵塞色谱柱的问题。因此，业界人员也将目光投向了结晶乳果糖上。而结晶乳果糖制备难度较大，成本高等特点也成为了一个制约因素。在产酶微生物筛选方面，酶活力高、稳定性高、产率高是微生物筛选上的目标。科研人员不仅对微生物来源方面进行研究，同时还进行了对现有菌株的诱变筛选以及基因工程菌株的构建等方面的研究。

综上，乳果糖的酶法制备还存在诸多技术难题与制约因素。酶法转化作为一种可克服化学合成局限性和问题的友好替代方法，在我国存在极大的应用空间和市场潜力，但与此同时，乳果糖生产制备领域需要解决的问题和填补的空白还有很多，仍需广大科研人员持续关注和深入研究。