贝莱斯芽孢杆菌HM-3分离鉴定及生防作用

摘要 从河北卢龙甘薯种植区发生茎线虫较重的田块选取未发生茎线虫的甘薯，从其根部采集土壤样品，以甘薯茎线虫为靶标进行活性菌株筛选。结果表明：筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌HM-3对甘薯茎线虫具有高达82.5%的触杀能力，具有快速繁殖和强大的定殖能力（151%）。经过10代培养后，该菌株对甘薯茎线虫的触杀效果仍保持在82.2%。此外，该菌株还具备解磷、解钾和固氮的功能，能够将土壤中的不溶或难溶磷、钾元素转化为作物可吸收的形式，并可固定空气中的氮元素供作物使用，尤其是其解钾能力最为突出。贝莱斯芽孢杆菌HM-3不仅对甘薯茎线虫病表现出显著的触杀效果，还能为甘薯提供必要的营养物质，促进作物生长发育和提高产量。

关键词 甘薯茎线虫病；筛选；鉴定；贝莱斯芽孢杆菌；促生

中图分类号 S 476 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2025）05-0096-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.05.019

Isolation，Identification and Biocontrol Effects of Bacillus velezensis HM-3

SONG Gen1，LIU Qing-qing2，ZHANG Bao-hai1 et al

（1. Qinhuangdao Hemiao Biotechnology Co.，Ltd.，Qinhuangdao，Hebei 066000;2. Hebei Normal University of Science and Technology，Qinhuangdao，Hebei 066000）

Abstract In this study，soil samples were collected from the roots of sweet potatoes that had not been affected by stem nematodes in fields heavily infested with stem nematodes in the sweet potato planting area of Lulong，Hebei. Active strains were screened with sweet potato stem nematode as the target. The research results showed that Bacillus velezensis HM-3 was identified with a contact killing ability of up to 82.5% against sweet potato stem nematodes，rapid reproduction，and a strong colonization ability （151%）. After 10 generations of cultivation，the contact killing effect of this strain on sweet potato stem nematodes remained at 82.2%. Additionally，Bacillus velezensis HM-3 was found to possess functions of phosphorus solubilization，potassium solubilization，and nitrogen fixation. Insoluble phosphorus and potassium elements in the soil were converted into forms that can be absorbed by crops，and nitrogen elements in the air were fixed for crop use，with potassium solubilization being particularly prominent. Bacillus velezensis HM-3 was observed to not only exhibit a significant contact killing effect on sweet potato stem nematode disease but also provide essential nutrients for sweet potatoes，promote crop growth and development，and increase yield.

Key words Sweet potato stem nematode disease;Screening;Identification;Bacillus velezensis;Promoting growth

我国线虫种类繁多，对不同寄主植物构成广泛威胁，涉及甘薯、马铃薯、当归、大蒜等多种作物和杂草，引发的线虫病害是农业、林业的第三大病害［1-2］。特别是甘薯茎线虫病作为一种破坏性极高的疾病，会严重侵染甘薯苗、甘薯蔓基部、薯块及粗根部位［3-4］，轻度感染可致使农作物减产10%～20%，而重度感染可能会减产70%以上甚至绝收。在北方的薯类种植区，尤其是河北和山东地区，已成为最严重的疾病之一［5-7］。此外，在储藏期，线虫侵染的甘薯会出现烂窑，育苗期烂床等问题［5，8］。因此，及时治理甘薯茎线虫病，提高作物产量和品质是当务之急。

目前，对甘薯茎线虫病的防治主要依赖于物理和化学防治。物理防治方法包括在育苗、种植及收获等过程中及时清除和集中焚烧病株残体。尽管这种方法能在一定程度上控制病害，但其操作复杂，耗时且效果有限［7］。相比之下，化学防治虽然相对有效［9］，但使用的化学杀线虫剂存在高毒、高残留的问题，对农作物和生产环境具有一定的安全威胁［5，10］。如，赵恭文等［11］研究发现，即便是采用噻唑膦防治根结线虫，仍难以避免农药残留、作物药害和环境污染等风险，且长期使用单一药剂还会导致病害产生抗药性，防效降低［12］。

在当今强调保护人类生活环境及农业可持续发展的背景下，生物防治技术的研究与应用至关重要［13］。生物农药以其毒性低和残留少的特点备受关注。然而，当前这类方法面临的主要挑战是其相对较低的防治效率。如，马明敏等［14］研究发现，使用10亿活孢子/g的淡紫拟青霉颗粒剂和10亿CFU/mL的蜡质芽孢杆菌悬浮剂对番茄根结线虫进行防治，取得的效果仅在75%和70%左右。宋振等［15］筛选出1株具有生防促生作用的菌株，该菌株对水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病的防治效果分别为74.57%和65.33%，对水稻芽长和根长的增长率分别达到37.70%和97.00%。该结果均凸显了提高生物防治技术效率的迫切需求。

生物防治技术的主要优势在于其利用微生物对作物产生正面影响，主要包括防治作物病害及促进作物生长。虽然最初人们更多关注其在促进作物生长方面的作用，但现阶段对其在防治病害方面的潜力给予了更多关注［13，16］。特别是在设施蔬菜生产中，生物防治技术已证明对线虫病害具有一定防控效果［6］。如刘强等［17］研究发现，贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌、蜡质芽孢杆菌对甘薯茎线虫病具有一定的防治能力。该研究核心目的是筛选出具有抗线虫病和促进作物生长双重功能的多功能菌株。自土壤中分离的微生物不仅能够更好地适应作物生长的环境，促进作物生长［18］，还能有效控制多种土传病害。因此，为了在大田条件下更理想地应用生物防治技术防治线虫病害，积极扩大对具有高效杀线虫能力微生物的研究和开发，充分利用自然界中的丰度资源显得很有必要。

因此，笔者在不同类型种植区的甘薯茎线虫发生地，采集甘薯根际土样，筛选出抗茎线虫病兼多重功能的微生物制剂，使其同时具备促生、固氮、解磷和解钾的功能，鉴定该微生物并命名，旨在为甘薯茎线虫病的防治及甘薯安全生产应用提供科学依据，对推动农业生产的提升及生态系统的可持续利用具有深远意义。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌：甘薯茎线虫母液（约含有茎线虫1 000条/mL）。供试菌株：HC-5、GS4-X1、GS2-X5、GS5-X1、GS3-X4，均由秦皇岛禾苗生物技术有限公司提供。供试培养基：LB培养基、PDA培养基、解钾菌培养基、解无机磷菌培养基、阿须贝氏（固氮）培养基。

主要仪器设备：离心机、摇床、显微镜、高压蒸气灭菌器、细菌培养箱、真菌培养箱、蒸气消毒器、超净工作台。

1.2 方法

1.2.1 甘薯茎线虫悬液的配制。

取甘薯茎线虫母液20 mL，加入80 mL蒸馏水充分混合，配制成茎线虫200条/mL悬液，备用。

1.2.2 生防菌的筛选。

在无菌操作条件下，从拮抗菌株固体培养基上挑取单菌落，接种于100 mL LB液体培养基中。于30 ℃ 180 r/min条件下振荡培养48 h，制成发酵培养液。随后将培养液在10 000 r/min下使用离心机离心10 min，随后取上清液并通过0.22 μm滤膜过滤，制得细菌发酵液清液，备用。在12孔板上，每孔加入500 μL准备好的甘薯茎线虫悬液（约含100条茎线虫）和500 μL细菌发酵液清液，轻轻摇匀以混合。以接种等量LB 液体培养基的处理作为对照，每处理重复3次。培养12 h后，使用显微镜检查各孔中的线虫反应。若观察到线虫身体僵硬且不活动，并且在转移至清水中12 h后仍未恢复活动，则判定为死亡。

线虫死亡率和校正死亡率计算公式如下：

死亡率=死亡的线虫数量/线虫总数×100%（1）

校正死亡率=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）×100% （2）

1.2.3 生防菌的生长测定。

将初筛细菌菌株分别接入100 mL LB液体培养基，在37 ℃ 160 r/min的条件下进行摇瓶培养。培养过程中，定期使用分光光度计检测OD600吸光度，以此来评估各菌株的生长速度，并筛选出繁殖速度快的细菌。

1.2.4 生防菌的性能测试。

1.2.4.1 遗传稳定性测试。

通过划线法将选定的细菌菌株在LB固体培养基上进行传代培养，持续至第10代。随后，应用12孔平板对峙法测定继代菌株对甘薯茎线虫的致死率，并将其校正死亡率与原始菌株（CK）进行对比。若经过10代培养的菌株显示出与CK相近的校正死亡率，表明菌株具备较高的遗传稳定性。试验中每处理重复3次，最终数据结果以平均值呈现。

1.2.4.2 定殖能力测试。

将筛选得到的细菌菌株接种于LB液体培养基中，设定培养条件为温度30  ℃和转速160 r/min，持续培养48 h。将发酵液配制成含菌量1.0×109 CFU/mL的菌悬液，待用。

将市场购买的淡紫拟青霉（DZ）接种于PD液体培养基上，设定培养条件为28  ℃和转速160 r/min，培养5 d，用筛网过滤出菌丝，将发酵液配制成含孢子量1.0×108 CFU/mL的菌悬液，待用。作为比较基准。将无菌土与固体发酵培养基按4∶1均匀混合，填充于直径为10 cm，高为11 cm的花盆中，总填充量达150 cm3。向其中浇施200 mL菌悬液，然后将花盆放置于温室中，温度控制在20～28 ℃，维持15 d，每4 d浇1次无菌水。在第15天，从花盆中6 cm深的土壤中取样1.0 g，检测所含有效活菌数。对每种菌株进行5次重复试验，计算每种菌株在1 g土壤中的定殖数量和定殖率。

定殖率=定殖数量/接种数量×100%（3）

1.2.4.3 促生性测试。首先，在无菌条件下，从低温存储的生防菌库中取1环菌株，接种于LB固体培养基平板上，并在37 ℃恒温培养箱中划线培养2 d，为后续试验作准备。接着，使用200 μL移液枪枪头在已纯化的菌株平板上均匀打孔，形成一致大小的菌饼。然后，将这些菌饼分别放置在解钾菌选择性培养基、解无机磷菌选择性培养基和阿须贝氏培养基上，适当标记。这些平板随后在37 ℃恒温培养箱中倒置培养7 d。若菌株在上述选择性培养基上生长，则表明具有解钾、解磷或固氮的生理功能，菌落生长迅速，说明该菌株在解钾、解磷、固氮方面功能较为强大；如果没有生长，则认为菌株不具备这些功能。