半夏外植体消毒方法比较研究

摘要[目的]研究不同种类消毒剂处理组合对半夏不同外植体污染率、成活率的影响，筛选出半夏适合进行组织培养的外植体种类以及相应消毒方式。[方法]分别以野生半夏、栽培半夏珠芽和块茎2个典型取材部位为外植体，设置不同消毒处理组合，进行污染率、成活率比较试验。[结果]野生半夏相同类型的外植体较栽培半夏污染率低、成活率高。野生、栽培半夏株芽作为外植体较块茎污染率低、成活率高。隶属函数值分析表明，半夏外植体最佳消毒方案为75%乙醇50 s、0.1% HgCl₂ 10 min，此时，野生半夏块茎、株芽的污染率分别为15%、10%，成活率均为73.89%，栽培半夏的块茎、珠芽的污染率分别为17.22%、11.11%，成活率分别为68.89%、70.56%。[结论]野生半夏株芽更适合作为半夏无菌苗培养的外植体，最佳消毒方案为75%乙醇50 s、0.1% HgCl₂ 10 min。

关键词半夏;组织培养;外植体;消毒方法

中图分类号S567.23+9文献标识码A

文章编号0517-6611（2022）13-0179-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.13.047开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Comparative Study on Disinfection Methods of Pinellia ternata Explants

ZHANG Zhao-ping CHEN Fang WANG Yu-hong et al

（1.Gansu Provincial Institute of Agricultural Engineering and Technology，Wuwei，Gansu 733006;2.Gansu Provincial Key Laboratory of Germplasm Innovation and Safe Utilization of Special Medicinal Plants， Wuwei， Gansu 733006）

Abstract[Objective]To study the effects of different types of disinfectant treatment combinations on the contamination rate and survival rate of different explants of Pinellia ternata， and screen out the types of explants suitable for tissue culture of Pinellia ternata and the corresponding disinfection methods. [Method]Wild Pinellia， cultivated Pinellia ternata buds and tubers were used as explants， and different disinfection treatment combinations were set up to compare the contamination rate and survival rate. [Result]The same type of explants of wild Pinellia ternata had lower contamination rate and higher survival rate than cultivated Pinellia ternata. Wild and cultivated Pinellia ternata buds as explants had lower contamination rates and higher survival rates than tubers.The membership function value analysis showed that the optimal disinfection scheme of Pinellia ternata explants was 75% ethanol for 50 s， 0.1% HgCl₂ for 10 min. At this time， the contamination rates of wild Pinellia ternata tubers and plant buds were lower， 15% and 10%， respectively. The survival rates were both 73.89%.The contamination rates of tubers and bulb buds of cultivated Pinellia ternata were 17.22% and 11.11% respectively， and the survival rates were 68.89% and 70.56%， respectively.[Conclusion]The buds of wild Pinellia ternata are more suitable as explants for aseptic seedling cultivation of Pinellia ternata. The optimal disinfection plan is 75% ethanol 50 s， 0.1% HgCl₂ 10 min.

Key wordsPinellia ternata;Tissue culture;Explant;Disinfection method

半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breitenb]又名三兴草、地星、三叶半夏等，为天南星科半夏属多年生草本植物，干燥块茎具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效[1-2]。除内蒙古、新疆、青海、西藏外，全国其他各地广布野生半夏，其已有2 000多年的临床药用历史，是30种应用最广泛的中药之一[3]。传统中药以采挖野生半夏为主，但由于半夏资源超量开发与利用，野生半夏资源已日渐枯竭[4]。为满足药用需求，半夏人工栽培的面积不断扩大，但在生产过程中发现，栽培半夏多采用小块茎、珠芽等方法进行繁殖[5]，不仅存在种苗短缺、繁殖系数较低的问题，而且多代无性繁殖易造成种质退化、病毒感染严重，引起叶片斑驳、变形、皱缩、卷曲等症状，使植株生长不良，减产可达60%，严重影响产量和药用品质[6]，同时，由于各地间相互引种，造成种质资源混乱，药材质量难以保证。采用组织培养技术不仅可以有效地保存半夏种质资源，而且能进行优良品种的快速繁殖，满足生产上的需要，从而有效保障半夏品质[7]。

半夏组织培养开始于20世纪80年代[8]，经过众多科学工作者的不断探索研究，目前已逐渐形成一套完整的组织培养体系[9-11]，但主要集中于脱毒快繁、遗传转化体系建立和生物碱代谢方面[12-15]，而对外植体的选择相关研究较少。外植体本身所特有的因子对培养物的器官分化和形态建成有决定性的影响[16]，因此，开展半夏组培过程中外植体种类及有效消毒方式的筛选对半夏胚性愈伤组织诱导十分必要。该研究分别以野生半夏和栽培半夏的珠芽和块茎2个典型取材部位为外植体，研究不同种类消毒剂组合对珠芽和块茎污染率、成活率的影响，分析比较野生与栽培半夏组织培养的差异，筛选出半夏适宜组织培养的外植体类型及最佳消毒方式诱导愈伤培养，以期为半夏组织培养快繁体系的建立及分子育种提供技术参考。

1材料与方法

1.1试验材料供试材料野生半夏块茎、株芽来自陇南市西和县，栽培半夏块茎、株芽来自天水市清水县。MS培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，其余化学试剂均为国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1外植体前处理。选择整齐、大小一致的野生半夏、栽培半夏块茎、珠芽，流水冲洗干净表层灰尘、泥土等物质，用手轻轻剥去种球、珠芽表层多余杂质;放入干净广口瓶内，用自来水冲洗数遍;加入少许洗洁精，轻摇冲洗30 min;反复用清水冲洗干净洗洁精，直至无泡沫;用超纯水冲洗5～6遍，放入紫外杀菌后的超净台，以备下一步工作。

1.2.2外植体消毒处理及接种。外植体消毒处理见表1。每次消毒剂处理期间均需不停摇晃消毒瓶，保证外植体充分接触消毒剂，取出后用无菌水清洗5～6遍备用。分别将种球、珠芽放置于干净滤纸上，每个消毒处理接种60瓶，每瓶接种1个外植体，培养基为不添加激素的MS培养基。培养30 d后统计污染率和成活率。外植体接种后，光照强度2 000 lx，光照时间 12 h/d，培养温度（25±1）℃。

1.3测定方法及指标采用以下公式计算污染率和成活率。

污染率=（污染材料数/总接种材料数）×100%（1）

成活率=（成活材料数/总接种材料数）×100%（2）

1.4统计分析试验数据用Excel整理，用SPSS 17.0软件进行方差分析及显著性分析。用隶属函数评价方法评价12个处理污染率和成活率。隶属函数值计算公式如下：

正向指标：x′_i=（x_i-x_min）/（x_max-x_min）

负向指标：x′_i=1-（x_i-x_min）/（x_max-x_min）

式中，x_i表示第i个指标值，x_min为第i个指标的最小值，x_max为第i个指标的最大值，若该指标与产量呈相反关系则为负向指标。

2结果与分析

2.1不同消毒处理下野生与栽培半夏外植体消毒比较

2.1.1块茎消毒比较。从图1可以看出，NaClO和HgCl₂不同消毒浓度和处理时间对野生、栽培半夏块茎污染率和成活率影响很大。X₁～X₉处理为NaClO消毒，同一浓度随处理时间延长，野生和栽培半夏块茎均表现为污染率降低，成活率升高，但变化幅度较小，无显著差异;相同处理时间（X₁、X₄、X₇，X₂、X₅、X₈，X₃、X₆、X₉），随着NaClO浓度升高，半夏块茎污染率降低，说明NaClO消毒浓度比其作用时间对半夏外植体污染率的影响更大。X₁₀～X₁₂处理为HgCl₂消毒，随着0.1% HgCl₂处理时间延长，野生、栽培半夏块茎污染率均表现为X₁₂<X₁₁<X₁₀，野生半夏块茎成活率为X₁₁>X₁₀>X₁₂，栽培半夏块茎成活率为X₁₀>X₁₁>X₁₂。

X₁～X₉处理半夏块茎污染率在73.33%～95.56%，成活率在1.67%～22.22%，X₁₀～X₁₂处理半夏块茎污染率在10.56%～22.22%，成活率在64.44%～73.89%，可见采用HgCl₂进行半夏块茎消毒污染率显著低于NaClO，成活率显著高于NaClO。综合考虑污染率及成活率，可知适合半夏块茎消毒的最佳处理为X₁₁。比较野生半夏块茎和栽培半夏块茎污染率和成活率可知，相同消毒处理下，野生半夏块茎与栽培半夏块茎污染率多数表现为野生半夏块茎污染率低于栽培半夏块茎污染率，野生半夏块茎成活率高于栽培半夏块茎成活率。