环境条件对小麦贮藏中主要危害真菌孢子及毒素生成的影响

摘要以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和黄曲霉（Aspergillus flavus）为研究对象，研究贮藏温度和湿度对小麦中主要危害真菌产孢的影响，利用快检方法即时测定AFB1、DON和ZEN毒素。结果表明，当水分含量为15.0%时，贮藏温度的上升与尖孢镰刀菌产孢量呈负相关，而其与黄曲霉产孢量呈正相关;当温度为25 ℃时，小麦水分的提高则会促进尖孢镰刀菌和黄曲霉大量产孢。在水分含量≤200%且温度≤30 ℃条件下，尖孢镰刀菌DON和ZEN毒素积累缓慢，小麦贮藏49 d后DON和ZEN毒素低于国家限量标准;当水分含量>15%且温度>20 ℃时，提高温度和湿度会加速黄曲霉B1毒素合成，小麦贮藏14～21 d后，毒素远超过国家的限量标准。

关键词水分;温度;孢子;真菌毒素

中图分类号S509.3文献标识码A

文章编号0517-6611（2022）13-0183-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.13.048

Effects of Environmental Conditions on the Formation of Spores and Toxins of Main Harmful Fungi in Wheat Storage

WU Qian-qian ZHOU Jin-wang

（1.School of Biology， Food  and Environment， Hefei University， Hefei， Anhui  230601;2.Anhui Gaozhe Information Technology Co.， Ltd.， Hefei，Anhui  230088）

AbstractTaking Fusarium oxysporum and Aspergillus flavus as the research objects， the effects of storage temperature and moisture content on the spore yield of the main harmful fungi in wheat were studied， and the AFB1， DON and ZEN toxins were determined immediately by the rapid detection method. The results showed that when the water content was 15.0%， the increase in storage temperature was negatively correlated with the spore production of Fusarium oxysporum， while it was positively correlated with the spore production of Aspergillus flavus. When the temperature was 25 ℃， the increase in the moisture content of wheat promoted the spore production of Fusarium oxysporum and Aspergillus flavus sporulate. When moisture content  ≤20% and temperature ≤30 ℃， the toxins of DON and ZEN of Fusarium oxysporum accumulated slowly， and DON and ZEN toxins of wheat after storage for 49 d were lower than the national limit standard;when the moisture content >15% and the temperature >20 ℃， increasing temperature and moisture content accelerated the synthesis of AFB1 toxin. After wheat was stored for 14-21 d AFB1 exceeded the national limit standard.

Key wordsMoisture;Temperature;Spores;Mycotoxins

镰刀菌、黄曲霉菌等是粮油作物的主要病原真菌，在温暖潮湿地区，发病严重时可降低小麦和玉米等作物品质[1-2]，对粮油生产构成严重威胁。小麦作为我国三大主粮之一，其生产和品质关系我国的经济发展和社会稳定，近年来随着小麦品种[3-4]、种植方式[5] 的优化和营养调控[6]，2020年小麦单产提高2%，年产量高达13 425万t，这给小麦仓储带来了挑战。小麦仓储时一旦环境温度和湿度发生改变，易受到植物病原菌侵染发生霉变，有的还产生真菌毒素，如黄曲霉产生黄曲霉毒素B1（AFB1），镰孢菌属真菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN），储色曲霉属和青霉属微生物产生赭曲霉毒素A（OTA）[2，7-8]，这对小麦及小麦加工农产品造成污染，影响粮饲安全，因此，不同国家制定上述4种毒素限量标准[9]，国家标准方法中检测真菌毒素对仪器条件要求较高，且操作复杂，牛伟伟等[10]分别采用高效液相色谱法或酶联免疫吸附法、快速试纸条法检测小麦粉中玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1，证明真菌毒素快速检测卡测定不仅操作简单，结果也可靠。因此，笔者以尖孢镰刀菌和黄曲霉为研究对象，模拟小麦的贮藏，采用快速试剂条法测定真菌毒素，即时准确了解贮藏温度和水分对真菌孢子和毒素的影响，为小麦的仓储安全和食品安全提供理论基础。

1材料与方法

1.1菌种尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和黄曲霉（Aspergillus flavus），由笔者所在课题组提供。

1.2主要耗材DON、AFB1、ZEN酶联免疫定量试剂条，均为北京中检葆泰生物技术有限公司提供。小麦籽粒由安徽省粮油研究所提供。

1.3仪器恒温恒湿培养箱，真菌毒素快速定量检测系统。

1.4试验方法黄曲霉感染小麦：小麦用无菌水洗涤3次后，接入黄曲霉菌悬液（200个/mL，按照粮食原始量的50%比例加入到试验小麦中，并搅拌均匀[11]），恒温恒湿培养。

尖孢镰刀菌感染小麦：小麦用无菌水洗涤3次后，接入尖孢镰刀菌菌悬液（200个/mL，按照粮食原始量的50%比例加入试验小麦中，并搅拌均匀[11]），恒温恒湿培养。

1.5测定项目与方法

1.5.1小麦水分的测定[12]。称取30 g小麦样品烘干至恒重，测得小麦原水分（水分=样品小麦湿重—样品小麦干重）。试验需要小麦水分计算公式：

小麦水分=（样品小麦含水量+外加水量）/加水后小麦重量×100%

1.5.2孢子的计数。采用显微血球计数板法计数。

1.5.3孢子增长速率rx定义[12]。指在孢子快速增长期单位质量小麦在单位时间内孢子平均增加量，单位：个/（g·d）。

2结果与分析

2.1小麦中尖孢镰刀菌产孢量及毒素

2.1.1贮藏温度对小麦表皮尖孢镰刀菌孢子数的影响。为了探究贮藏温度对尖孢镰刀菌孢子数的影响，分别在贮藏温度20、25和30 ℃，水分15.0%的条件下贮藏，每7 d取样，测定样品中孢子数，结果见图1、2。

由图1、2可知，贮藏前期（0～28 d）尖孢镰刀菌孢子数增加缓慢;从第29天开始，孢子进入快速生长期。当温度为20 ℃时，尖孢镰刀菌孢子增长速率为8.50个/（g·d），分别是25和30 ℃时的1.20和1.52倍，这表明20 ℃更有利于尖孢镰刀菌孢子形成。温度对尖孢镰刀菌产孢量、孢子增长速率的影响依次是20 ℃>25 ℃>30 ℃。

2.1.2水分含量对尖孢镰刀菌孢子数的影响。为了探究水分对尖孢镰刀菌小麦孢子数的影响，分别在水分含是15.0%、17.5%和20.0%、温度25 ℃的条件下储藏，对样品孢子数进行计数，结果见图3、4。

由图3、4可知，在贮藏前期（0～28 d）尖孢镰刀菌产孢量少，而后尖孢镰刀菌进入快速产孢期;在快速产孢期，随着小麦水分含量的提高，尖孢镰刀菌产孢量也随之增加，小麦水分含量对微生物产孢量的影响依次为20.0%>17.5%>15.0%。当水分含量为20.0%时，尖孢镰刀菌孢子增长速度为14.21个/（g·d），分别是水分含量15.0%和17.5%的2.00和1.26倍。

2.1.3环境因素对尖孢镰刀菌产毒的影响。呕吐毒素（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）是小麦需要同时检测的食品安全指标。由表1可知，在小麦水分含量为15.0%条件下，当贮藏温度从20 ℃提高到30 ℃时，此时尖孢镰刀菌DON毒素开始合成时间则提前到第21天，且DON毒素量均低于国标中DON限量标准，这说明贮藏温度不仅影响DON毒素量，而且还影响其开始合成时间，这与熊科等[13]研究结果一致;对于ZEN而言，当水分含量为15.0%时，温度变化对ZEN毒素量及合成时间的影响不明显，且ZEN含量也低于国标中ZEN限量标准。

由表2可知，不同小麦水分含量下随着小麦贮藏时间延长，DON、ZEN毒素积累量越高，到小麦贮藏49 d，DON、ZEN毒素量均未超过国标中限量标准。这可能是因为尖孢镰刀菌产毒素对湿度的要求较高，当温度为22～28 ℃且含水量为40%～50%时，DON、ZEN毒素才会大量积累。另外小麦贮藏后期（第35～49天），小麦水分含量与DON、ZEN毒素积累量呈一定正相关性。

2.2环境条件对小麦中黄曲霉产孢量及AFB1毒素的影响

2.2.1贮藏温度对黄曲霉产孢量及AFB1毒素的影响。为了探究贮藏温度对小麦中黄曲霉孢子数的影响，分别在贮藏温度为20、25和30 ℃，水分为15.0%的条件下贮藏，每7 d取样，测定样品中孢子数，结果见图5。

由图5可知，当贮藏温度为20 ℃时，在第0～35天黄曲霉产孢量少，第36天进入快速产孢期;当贮藏温度提高到25和30 ℃，则黄曲霉提前7 d进入快速产孢阶段，此时孢子增长速率分别为10.56和12.65个/（g·d），分别是20 ℃时孢子生长速率的1.63和1.95倍。

由图6可知，温度越高，越有利于AFB1毒素合成。当贮藏温度为20 ℃，在整个小麦贮藏期间（0～49 d）黄曲霉产AFB1毒素维持在较低水平，略高于国标中AFB1的限量标准（5 μg/kg）;在25和30 ℃下小麦贮藏49 d，AFB1毒素分别为414和804 μg/kg，远超过AFB1限量标准。

2.2.2水分含量对黄曲霉产孢量及AFB1毒素的影响。为了探究水分含量对黄曲霉孢子数的影响，分别在水分含量为15.0%和20.0%、温度为25 ℃的条件下贮藏，对样品的孢子数进行计数，结果见图7、8。

由图7可知，小麦水分含量影响黄曲霉快速产孢时间，当小麦水分含量为15.0%时，黄曲霉第29天进入快速产孢期;当水分含量提高到20.0%时，黄曲霉快速产孢时间提前了7 d，此时其孢子的增长速率为16.36个/（g·d），分别是水分含量为15.0%和20.0%的1.55和1.20倍。

由图8可知，在贮藏前期（第0～7天），小麦的水分含量对黄曲霉产AFB1毒素的影响无明显差异;随着贮藏时间的延长，小麦水分含量越大，黄曲霉产AFB1毒素量越多，这表明高湿条件更有利于AFB1的合成。当温度为25 ℃，随着小麦水分逐渐提高，AFB1在第8～14天陆续开始合成，此时黄曲霉孢子数维持在10³/g数量级（P<0.05），因此，可以利用小麦中黄曲霉孢子数作为小麦产AFB1的预判方法之一。